METTL3调节奶牛乳腺乳蛋白和乳脂肪合成的分子机制

发布时间：2020-06-08 06:33

【摘要】：乳中最为重要的是乳蛋白和乳脂肪的含量以及组成,但我国牛奶中乳蛋白和乳脂肪的含量较低,寻找调控乳蛋白、乳脂肪关键信号分子为提高奶牛乳品质提供重要的实验依据。METTL3(methyltransferase-like protein 3)也称m~6A甲基转移酶,能够催化mRNA生成m~6A。大量研究表明METTL3通过调控mRNA中m~6A甲基化水平,进而对细胞中蛋白质的合成起到重要的调节作用。实验室前期结果表明,METTL3通过调节mTOR和SREBP-1c基因的表达,从而影响BMECs中乳蛋白、乳脂肪的表达。本实验拟研究METTL3促进mTOR和SREBP-1c基因的表达和分子机制,以及p-GlyRS作用于METTL3的分子机制。甘氨酰tRNA合成酶(GlyRS)具有非经典功能,通过蛋白质免疫共沉淀质谱分析表明,GlyRS在胞核中以p-GlyRS的形式与其下游蛋白METTL3结合,实验室前期研究表明p-GlyRS可能具有激酶活性,p-GlyRS可能使METTL3磷酸化。从而激活METTL3,本研究揭示METTL3调控BMECs中乳蛋白、乳脂肪的分子机制以及p-GlyRS调控METTL3的分子机理。组织块法获取奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs),利用免疫荧光法及Western blotting(WB)检测BMECs中CK18(Cytokeratin 18)和β-酪蛋白(β-casein)的表达,对METTL3基因进行过表达、干扰,WB实验检测BMECs中β-casein的表达情况,同时利用甘油三酯试剂盒检测BMECs中甘油三酯的表达。通过Dot blot实验检测BMECs中mRNA m~6A的表达情况。RIP实验检测METTL3靶蛋白mTOR和SREBP-1c的mRNA m~6A表达情况。FRET实验,分析两蛋白之间的相互作用。通过激光共聚焦共定位实验,分析添加蛋氨酸和雌激素后p-GlyRS与METTL3相互作用有何变化。通过体外激酶实验检测p-GlyRS能否激活GST-METTL3。实验结果表明获得了具有泌乳功能的奶牛乳腺上皮细胞。METTL3过表达后,β-casein的表达量增加同时细胞内脂滴数量明显增多,脂滴体积变大,细胞中TAG合成量增加。而当METTL3抑制时,β-casein的表达量降低同时细胞内脂滴数量减少,脂滴体积变小,细胞中TAG合成量降低。RIP实验结果表明METTL3过表达、干扰后BMECs中mTOR和SREBP-1c的mRNA m~6A表达增多、减少。FRET结果表明p-GlyRS与METTL3的FRET值大于20%,激光共定位实验表明,添加蛋氨酸和雌激素后p-GlyRS与METTL3的相互作用增加,体外激酶实验表明,p-GlyRS能够使METTL3磷酸化。综上所述,METTL3是BMECs中重要的信号分子,正向调控BMECs中乳蛋白和乳脂肪的合成。METTL3能够正向调控mRNA m~6A水平,正向调控靶基因mTOR和SREBP-1c的mRNA m~6A水平。p-GlyRS与METTL3有直接相互作用,蛋氨酸和雌激素能够促进p-GlyRS与METTL3的结合。体外激酶活性实验表明p-GlyRS能够使GST-METTL3磷酸化。以上实验有助于揭示METTL3调控BMECs中乳蛋白、乳脂肪的分子机制以及p-GlyRS调控METTL3的分子机理。
【图文】：

乳腺上皮细胞,原代培养,成纤维细胞

可以观察到成纤维细胞周围有大量的呈椭圆形的乳腺上皮细胞产生如图3-1B，肉眼观察瓶中的乳腺上皮细胞至 50%时，用 D-Hanks 吹掉组织块，利用成纤维细胞和乳腺上皮细胞对胰酶的敏感度不同，将成纤维消化掉，，分装在另一瓶细胞瓶中如图 3-1C，瓶中只剩下乳腺上皮细胞经过两天的时间，得到纯的乳腺上皮细胞如图 3-1D。A：成纤维细胞； B：成纤维和乳腺上皮细胞；C：纯化后的成纤维细胞； D：纯化后的乳腺上皮细胞；图 3-1 乳腺上皮细胞的原代培养与纯化Fig. 3-1 Primary culture and purification of BMECs

腺上皮细胞

图 3-2 奶牛乳腺上皮细胞的 CK18 鉴定Fig. 3-2 Identification of BMECs of CK18 蛋白质免疫印迹法鉴定 BMECsB 检测两种细胞中 CK18 与 CSN2 的表达。如图 3-3，CK18 和 CSN2 在 B
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823

【参考文献】