解淀粉芽孢杆菌TL对肉鸡回肠组织基因表达的影响

发布时间：2020-06-08 16:13

【摘要】：解淀粉芽孢杆菌为革兰氏阳性菌,与枯草芽孢杆菌的亲缘性较高,其代谢产物包括淀粉酶、蛋白酶和多种抗菌物质。现有研究表明,解淀粉芽孢杆菌TL具有与金霉素类似的促进肉鸡生长的效果,并能促进肉鸡蛋白质的合成,脂类的代谢。在免疫器官指数方面,解淀粉芽孢杆菌TL可以刺激肉鸡免疫器官的生长发育。本研究旨在通过转录组学技术发现解淀粉芽孢杆菌TL对生长前期肉鸡回肠组织基因表达的影响,分析回肠组织基因表达与促生长机制之间联系。益生菌组在基础日粮中添加解淀粉芽孢杆菌TL,抗生素组在基础日粮中添加金霉素,对照组为基础日粮。试验结果如下:1.基因表达水平分析:以FPKM1作为基因表达的筛选标准,对照组表达的基因个数为14008,抗生素组表达的基因个数为14211,益生菌组表达的基因个数为14402。有13600个基因在三个组中都有表达,其中,对照组独特表达的基因个数为158,抗生素组独特表达的基因个数为137,益生菌组独特表达的基因个数为252。以FPKM500作为高丰度表达基因的筛选标准,对照组高丰度表达基因有172个,益生菌组高丰度表达基因有166个,抗生素组高丰度表达基因有199个。其中,丙酮酸激酶(PKM)、前胸腺素(PTMA)和热应激蛋白(HSPs)在益生菌组和抗生素组高表达,在对照组非高表达。结果提示益生菌组和抗生素组能量代谢速率快,免疫器官发育较早,抗氧化抗应激能力强。2.差异表达基因筛选:以log_2fold change≥l或log_2fold change≤-1,且FDR(False discovery rate)0.05为筛选标准确定差异表达基因。其中,log_2fold change≥l且FDR0.05的基因确定为上调表达基因,log_2fold change≤-1且FDR0.05的基因确定为下调表达基因。抗生素组与对照组相比,共检测到141个差异表达基因,上调表达基因3个,下调表达基因138个;益生菌组与对照组相比,共检测到510个差异表达基因,上调表达基因163个,下调表达基因347个。抗生素组相对益生菌组检测到1个下调表达基因。对差异表达基因进行聚类分析,结果提示益生菌组和抗生素组相同的差异表达基因在两组中表达趋势一致,并与对照组不一样。因此,益生菌组与抗生素组在促进肉鸡生长方面有相似的作用机制。3.差异表达基因功能注释分析:从差异表达基因的GO分析发现,差异表达基因功能主要与炎症反应、免疫反应、基因表达、离子运输、脂肪代谢等相关,信号通路分析发现:细胞因子与细胞因子受体相互作用、胰岛素信号通路、丁酰苷菌素和新霉素的生物合成、泛素介导的蛋白质水解信号通路在两组中聚集程度较高。分析解结果表明添加解淀粉芽孢杆菌TL后,病原减少,因此导致免疫刺激减少,最终免疫活动减少和促进脂肪沉积。4.差异表达基因验证:通过RT-qPCR法和体外细胞试验验证,试验结果发现,RT-qPCR检测结果与转录组数据分析结果基本一致,解淀粉芽孢杆菌TL刺激小肠上皮细胞(IPEC-J2)可导致细胞的LEPR基因表达量上调,说明转录组测序数据和分析结果真实可靠。
【图文】：

流程图,转录组,组分,流程

图 2-1 转录组组分析流程Fig.2-1 The process of Transcriptome analysis2.4.1 cDNA 文库构建及 Illumina 测序用带有 Oligo（dT）的磁珠，通过 A-T 互补配对与 mRNA 的 ployA 尾结合的方式富集真核生物的 mRNA。随后加入 fragmentation buffer 将 mRNA 打断成短片段，以 mRNA 为模板，用六碱基随机引物（random hexamers）合成一链 cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs 和 DNApolymerase I 合成二链 cDNA，随后利用 AMPureXP beads 纯化双链 cDNA。纯化的双链 cDNA 再进行末端修复、加 A 尾并连接测序接头，然后用 AMPure XP beads 进行片段大小选择，最后进行 PCR 富集得到最终的 cDNA 文库。文库构建原理如下图（2-2）：

序列,文库构建,文库

图 2-2 文库构建（Marioni 2008）Fig.2-2 Library construction成后，先使用 Qubit2.0 进行初步定量，，稀释文库至100 对文库的插入片段长度（insert size）进行检测，-PCR 方法对文库的有效浓度进行准确定量（文库有。合格文库采用 IlluminaHiSeq 平台进行测序。序数据质量控制得到的原始图像数据文件经 CASAVA 碱基识别（B序序列（Sequenced Reads），也称为 Raw Data 或 R检查、 A/T/G/C 含量分布检查后将数据进行过滤，带接头(adapter)的 reads；去除 N（N 表示无法确定reads；去除低质量 reads（Qphred <= 20 的碱基数占 reads）。其中，每个碱基测序错误率是通过测序 Ph
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S831.2

【参考文献】