PD-1通路在BVDV抑制牛外周血T淋巴细胞增殖、诱导凋亡中的作用及其机制

发布时间：2020-06-09 02:28

【摘要】：牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD)是在世界范围内对养牛业造成巨大经济损失的重要传染病,也是规模化养牛场和国际贸易中重点检疫的牛传染病。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)急性感染可导致牛外周血淋巴细胞(PBL)减少、凋亡和免疫抑制。在慢性病毒感染过程中PD-1信号通路可以介导协同抑制信号,抑制T淋巴细胞的活化、增殖,诱导凋亡。然而,在急性病毒感染中PD-1通路对T细胞的调控作用并不明确。尤其是在BVDV急性感染中PD-1通路是否参与调控了PBL的减少和凋亡,促进免疫抑制的形成,尚不明确。为了确定PD-1通路是否与BVDV急性感染导致的牛PBL减少和凋亡具有相关性。首先,采用梯度密度水平离心法从BVDV急性感染牛颈静脉抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC),再通过免疫微珠法从PBMC中分选出PBL和CD14~+外周血单核细胞(PBM),qRT-PCR和Western blot检测两种细胞亚群的PD-1和PD-L1表达水平,流式细胞术检测PBL凋亡,CCK-8法检测PBL增殖。其次,选择CP型BVDV-1 NADL株和NCP型BVDV-1KD株分别体外感染健康牛PBMC,再分选出PBL和CD14~+PBM,检测PD-1和PD-L1表达水平,以及PBL增殖和凋亡情况。结果表明,与健康牛相比,BVDV急性感染牛PBL的PD-1 mRNA(p0.001)和蛋白表达水平(p0.01)显著上调,CD14~+PBM的PD-L1mRNA(p0.01)和蛋白表达(p0.01)显著上调,同时PBL的凋亡显著增加(p0.001),增殖显著减少。其次,CP和NCP型BVDV体外感染均可诱导PD-1和PD-L1 mRNA和蛋白表达的显著上调,随着感染时间的延长PD-1和PD-L1 mRNA的表达水平逐渐升高,PD-1和PD-L1的表达上调伴随着PBL凋亡显著增加(p0.05)和增殖的显著减少。为了确定阻断PD-1通路对PBL凋亡和增殖的影响。选择CP型BVDV-1 NADL株和NCP型BVDV-1 KD株分别体外感染健康牛PBMC,采用单抗阻断PD-1通路,再通过流式细胞术检测PBL凋亡,CCK-8法检测PBL增殖,ELISA检测细胞因子分泌,以及qRT-PCR检测病毒载量。结果表明,阻断PD-1通路可以显著减少BVDV体外感染导致的PBL凋亡(p0.05),恢复了PBL的增殖(CP型BVDV,p0.05),降低了病毒载量(p0.05),增加了IFN-γ(CP型BVDV,p0.01)和IL-2(p0.05)分泌水平。为了确定BVDV体外感染中阻断PD-1通路对PBL亚群凋亡和增殖的影响。选择CP型BVDV-1 NADL株和NCP型BVDV-1 KD株分别体外感染健康牛PBMC,通过免疫磁珠法分选CD4~+T细胞、CD8~+T细胞和CD21~+B细胞等PBL亚群,检测PBL亚群PD-1蛋白表达情况。采用单抗体外阻断PD-1通路,检测PD-1阻断对高表达PD-1的PBL亚群凋亡和增殖的影响。结果表明,CP和NCP型BVDV体外感染均能显著提高CD4~+(CP型BVDV,p0.01;NCP型BVDV,p0.001)和CD8~+T细胞(CP型BVDV,p0.001;NCP型BVDV,p0.05)表面PD-1的表达,而CD21~+B细胞表面PD-1表达差异不显著。此外,PD-1阻断可以显著减少CP和NCP型BVDV感染导致的CD4~+和CD8~+T细胞凋亡。在CP型BVDV感染中PD-1阻断可以显著恢复CD4~+和CD8~+T细胞增殖。但在NCP型BVDV感染中PD-1阻断仅显著恢复了CD4~+T细胞增殖。为了确定BVDV体外感染中PD-1通路调控CD4~+和CD8~+T细胞凋亡和增殖的分子机制。采用单抗体外阻断PD-1通路,通过Western blot检测PD-1通路下游调控凋亡和增殖的关键信号分子蛋白丰度和磷酸化水平。结果表明,在CP型BVDV体外感染中阻断PD-1通路可以显著上调CD4~+和CD8~+T细胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR和p-ERK表达,同时显著下调与凋亡有关的信号分子cleaved-caspase 9和cleaved-caspase 3的表达。在NCP型感染中阻断PD-1通路可以显著上调CD4~+和CD8~+T细胞的p-PI3K和p-Akt的表达,下调cleaved-caspase 9和cleaved-caspase 3表达,此外,CD4~+T细胞p-mTOR的表达显著上调(p0.01),但CD8~+T细胞中表达变化不显著,CD4~+和CD8~+T细胞中p-ERK的表达变化均不显著。综上所述,CP型BVDV可以通过PD-1介导的协同抑制信号,抑制下游PI3K/Akt/mTOR和ERK通路,激活caspase 9/caspase 3凋亡信号通路,进而抑制CD4~+和CD8~+T细胞增殖,诱导凋亡。NCP型BVDV通过PD-1通路抑制ERK通路,进而抑制CD4~+T细胞增殖,通过激活caspase 9/caspase 3通路,诱导CD4~+和CD8~+T细胞凋亡,但不能通过抑制PI3K/Akt/mTOR和ERK通路,来抑制CD8~+T细胞的增殖。我们推测NCP型BVDV可能通过PD-1以外的其他共抑制分子或多个共抑制分子协同介导的免疫负调控信号,抑制CD4~+和CD8~+T细胞的增殖,该推论仍有待于进一步研究。本研究为探索BVDV免疫抑制的分子机制和抗PD-1治疗药物提供了科学依据。
【图文】：

结构蛋白,与非

要特征的接触性传染病，该病广泛分布于世界各地的养牛国家[1]，是养牛场和国际贸易重点检疫的传染病，给全世界养牛业造成了巨大经济损失[2]。世界动物卫生组织（OIE）BVD-MD 列入必须通报的牛传染病[3]，BVD-MD 已对我国乃至全世界的养牛业的健康、续发展造成了巨大的冲击。1.1.1 病毒特性BVD-MD 的病原为牛病毒性腹泻病毒（BVDV），属黄病毒科（Flaviviridae）、瘟病属（Pestivirus）的成员[4]，同科成员还包括：乙肝病毒（HCV）、黄热病毒（YFV）、西罗河病毒（WNV）、日本脑炎病毒（JEV）、登革热病毒（DV）、猪瘟病毒（CSFV）和界病病毒（BDV）等[5]。病毒的基因组（Genome）为单股正链的 RNA，全长约 12.5 kb含有一个开放阅读框架（ORF）[6]，Genome 被翻译为一个多聚蛋白，，随后在宿主细胞和毒的蛋白酶作用下被裂解为不同的病毒蛋白，包括 4 种结构蛋白[7]（Core、Erns、E1 和 E和 8 种非结构蛋白（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B）[8]（见图 1-1

信号转导,文献,清除病毒,共抑制

10图 1-2 PD-1 及其下游主要信号转导（引自文献[163]）Fig.1-2 PD-1 and its downstream signal transduction.2.4 PD-1 在病毒感染中的研究进展众所周知，淋巴细胞（如 T 细胞和 B 细胞）在控制和清除病毒感染中清除病毒方面至关重要的作用。淋巴细胞活化的调节不仅需要抗原特异性 TCR 识别抗原，还需要共分子，分为共刺激和共抑制分子。PD-1 作为一种共抑制分子，通过结合其配体（如 PD-L制 TCR 介导的淋巴细胞活化，增殖，诱导淋巴细胞凋亡。在慢性病毒感染过程中 PD-1 对淋巴细胞的免疫负调控作用已被广泛证实。PD-1 IV 特异性 CD8+T 细胞上显著上调，其表达水平与病毒载量呈正相关[111]，与 CD4+T数量成负相关[112]。Barber 等发现，在小鼠模型中高表达 PD-1 的 CD8+T 细胞呈现功能
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.23

【参考文献】