猪附红细胞体病诊断方法建立及感染情况调查

发布时间：2020-06-10 15:07

【摘要】：附红细胞体病(Eperythrozoonosis,EHS)是由寄生在多种哺乳动物血液红细胞表面无细胞壁结构的生物—附红细胞体(Eperythrozoon)引起的一种重要的人畜共患病。猪附红细胞体病在猪群中普遍存在,临床表现为发烧,皮肤出现发绀,出血点,黄疸和瘀斑等症状。附红细胞体能导致机体免疫力下降,母猪繁殖障碍,严重的可引起死亡。由于猪附红细胞体一直缺乏规范有效的诊断方法和处于隐性感染状态易被忽视,因此建立准确有效的PCR诊断方法,在此基础上研制猪附红细胞体PCR诊断试剂盒是对猪附红细胞体病诊断与防控是十分有必要的。本研究将从以下三个方面进行。根据已经报道的猪附红细胞体MSG1基因序列在其保守域内设计了一对特异性引物,进行聚合酶链式反应(PCR)。PCR最适合的退火温度为55℃,胶回收产物测序,测序结果与预估结果一致大小为1011bp,与Gen Bank上所公布的附红细胞体MSG1基因(登录号AM407404.1)序列同源性一致。本试验建立的PCR诊断方法的特异性强,与健康猪的血液、弓形虫、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、猪伪狂犬、猪瘟、猪圆环Ⅱ均无交叉反应。阳性猪血样检测最低DNA浓度为20.0 fg/ul。该PCR诊断方法具有操作简单、准确性高、灵敏度高等特点。为猪附红细胞体病诊断以及试剂盒的组装和感染情况调查提供了有力的手段。根据本研究建立的PCR诊断方法,通过构建阳性对照、阴性对照,配制PCR引物和PCR反应液,组装了猪附红细胞体病PCR诊断试剂盒。对试剂盒进行了特异性、灵敏度、重复性、稳定性以及保质期试验。并利用组装的检测试剂盒,对临床阳性样本进行了检测,以确定其准确性。与健康猪血样,弓形虫,猪细小病毒,猪伪狂犬,猪流行性腹泻,猪乙型脑炎,猪圆环Ⅱ型病毒的基因组均无交叉反应,试剂盒最低检测浓度为32.5fg/ul,重复性良好,经过40次反复冻融试剂盒阳性对照扩增结果仍有条带,-20℃条件下试剂盒保质期为6个月。利用试剂盒对湖南省部分地区送检的337头份猪血液样本进行附红细胞体感染率检测以及对其中100份育肥猪血液样进行猪瘟、蓝耳、猪伪狂犬病毒进行检测。对湖南省内湘潭、益阳、衡阳、永州、郴州五个地区猪附红细胞体感染情况调查结果显示,郴州地区猪附红细胞体感染率最高为69.2%,永州猪附红细胞体感染率为61.5%,衡阳地区猪附红细胞体感染率58.4%,湘潭地区猪附红细胞体感染率为58.4%,益阳感染率最低为55.3%。对不同种群感染情况调查可知种公猪的感染率为82.1%,母猪感染率为74.1%,育肥猪感染率为43.8%,仔猪感染率为26.6%。混合感染情况调查:单独感染率为4.6%,其中与猪瘟混合感染率为83.7%,与蓝耳混合感染率为88.3%,与猪伪狂犬混合感染率为51.1%,四种疾病混合感染率为41.8%。结论:本研究建立了准确的诊断方法,组装了猪附红细胞体诊断试剂盒,对临床感染情况调查发现猪附红细胞体病感染情况普遍存在,以混合感染形式为主,公猪感染率大于母猪与育肥猪,育肥猪感染率大于仔猪。
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.28

【参考文献】