碳酸酐酶4基因重组质粒免疫对母鸡种蛋受精率的影响

发布时间：2020-06-10 23:56

【摘要】：贮精腺(sperm storage tubules,SSTs)是禽类特有的管状腺体,位于生殖道子宫阴道交界处,主要功能是长期储存精子并维持其活力,使禽类能持续生产受精蛋。贮精腺存在大量的碳酸酐酶,其中碳酸酐酶4(CAⅣ)在子宫阴道交接部大量表达,由此推测CAⅣ可能参与禽类精子储存,因此研究CAⅣ在贮精腺长期储存精子过程中的功能对探究禽类贮精腺长时间储存精子并维持其活力的生理机制具有重要意义。本试验分析鸡CAⅣ序列的生物信息,寻找蛋白的抗原表位,构建pVAX-CAⅣ-asd重组质粒,并按不同剂量免疫母鸡。将105只38周龄产蛋母鸡随机分为7组,每组15只,第1到第5组依次免疫10、50、100、150、200μg的pVAX-CAⅣ-asd重组质粒,第6组免疫100μg的pVAX-asd空质粒,第7组注射生理盐水,每组免疫2次,免疫间隔为21天。试验期内每天收集种蛋,记录产蛋量,每周采集血液,检测母鸡血清中CAⅣ抗体含量、L-乳酸含量以及母鸡生殖部CAⅣ mRNA和MCT4 mRNA的表达量,测定母鸡的体重,记数蛋黄膜的精子穿孔数,计算受精率。结果表明:1.鸡CAⅣ由316个氨基酸构成,是亲水性较强的膜结合蛋白,二级结构上α螺旋和β折叠较多,且抗原表位丰富,存在信号肽。CAⅣ蛋白有多个丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点及3个酪氨酸磷酸化位点,并且第165位的天冬酰胺可能为糖基化位点。进化分析表明鸡与火鸡CAⅣ最有可能来源于同一祖先,它们的CAⅣ氨基酸序列相似性最高,为94.01%,其后依次是珍珠鸡、鹌鹑、大雁和绿头野鸭,与绿头野鸭的序列相似度最低,为84.35%,表明禽类CAⅣ具有较高的序列保守性。2.实验组血清中抗CAⅣ的抗体水平从第7 d至实验结束均显著高于两个对照组,并在免疫后第28 d达到峰值,之后抗体水平逐渐减少(p0.05)。3.用CAⅣ重组质粒免疫母鸡,实验组母鸡UVJ部位的CAⅣ mRNA相对表达量显著低于空载体对照组和生理盐水对照组,实验组伞部CAⅣ mRNA相对表达量显著低于注射生理盐水对照组,第4-5组母鸡UVJ部位MCT4 mRNA相对表达量显著低于生理盐水对照组,5个实验组伞部MCT4 mRNA的相对表达量显著低于生理盐水对照组(p0.05)。4.免疫组与对照组母鸡体重和产蛋量没有显著差异(p0.05),从免疫第2周开始,200ug剂量组种蛋受精率显著降低(p0.05)。免疫后实验组的精子穿孔数显著降低(p0.05),L-乳酸也减少(p0.05)。综上,CAⅣ重组质粒免疫母鸡不影响体重,降低CAⅣ和MCT4的mRNA表达量,可降低种蛋受精率、血清L-乳酸含量、蛋黄膜上的精子穿孔数,因此CAⅣ可能与MCT4共同作用,为长期维持精子活力提供适宜的微环境。
【图文】：

禽类,聚类分析,火鸡

表 2-2 不同物种间禽类 CAIV 序列相似度对比Table.2-2 Comparison of chicken CAIV sequence similarity between 6 bird species物种Species相似度（%）Similarity（%）鸡（Gallus gallus） 100%火鸡（Melegris gallopavo） 94.01%鹌鹑（Coturnix japonica） 92.74%珍珠鸡（Numida meleagris）大雁（Anser cygnoides）绿头野鸭（Anas platyrhynchos）91.38%85.55%84.35%根据 CAⅣ蛋白序列构建不同禽类的聚类树（图 2-1），该聚类树上存在两个的类群（clusters），分别是陆禽和水禽，这与动物分类学的分类结果一致。在中，鸡 CAIV 与火鸡离的距离最近，亲缘关系最为密切，说明它们可能起源于个祖先。

疏水性,亲水性,氨基酸,负值

图 2-2 鸡 CAⅣ的亲水性和疏水性横坐标代表氨基酸位置，纵坐标代表数值，疏水性由正值表示，该值越大表示疏水性越强，反之，负值代表亲水性。Fig.2-2 Hydrophobicity/hydrophility of chicken CAⅣThe abscissa represents the amino acid position, and the ordinate represents the value. Thehydrophobicity is represented by a positive value. The larger the value is, the greater thehydrophobicity is, and the negative value represents the hydrophilicity.2.3.4 鸡 CAIV 的的二级结构分析从图 2-3 可以看出，分析鸡 CAIV 的二级结构发现，鸡 CAⅣ的 α 螺旋（红色区域）最多，共有 221 个，主要集中在氨基酸位置的第 14~18、27~32、41~49、86~89、110~111、113~119、124~128、139~147、152~~167、188~193、200~209、218~221、270~280、292~299 处；β 折叠（绿色区域）共有 132 个，大多数在氨基酸位置的第3~13、19~26、57~72、230~261、300~314 处；β 转角（蓝色区域）有 43 个，位置
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S831

【相似文献】