埃里希氏体病流行病学调查及E.canis嵌合VLPs的免疫原性研究

发布时间：2020-06-11 00:04

【摘要】：埃里希氏体病属于一类由蜱传播的自然疫源性疾病,随着病原种类的增加,新病型的出现以及人的感染,引起了全球学者的重视。当前存在三大急需解决的科学问题:(1)目前国内尚未针对埃里希氏体病进行系统的流行病学调查,蜱作为该病的唯一传播媒介,调查蜱携带埃里希氏体情况具有重要的经济及公共卫生学意义。(2)对于埃里希氏体病的血清学诊断方法国内尚未有过报道,该病临床症状不典型且与某些病毒性疾病相似,由于缺乏有效诊断方式,染病动物不能及时确诊就医,往往错过最佳治疗时机。(3)该病目前并无商品化疫苗可用。研究人员对埃里希氏体疫苗的研发主要集中在弱毒疫苗、亚单位疫苗及核酸疫苗方面,然而随着毒株基因型的增多,单一抗原或单一毒株不能产生完全的保护效应。针对以上问题,本研究对我国部分地区蜱携带埃里希氏体情况进行分子流行病学调查,为该病原的分布情况提供一定数据;建立了E.canis抗体检测间接ELISA方法并初步应用于临床,以期提供简便、快捷、有效的临床诊断方法;采用E.canis gp36序列全长替换NDV HN蛋白胞外域的策略,与NDV M蛋白形成嵌合病毒样颗粒cVLPs-HNcgp36,并对其进行免疫原性分析,为E.canis新型疫苗的研制提供新的策略。主要研究内容如下:1、我国部分地区蜱携带埃里希氏体分子流行病学调查本研究于2016-2018年间在我国内蒙古自治区、黑龙江省、吉林省、浙江省和海南省五个省份牛、羊、犬及黄鼠体表采集蜱虫样品1142份,采用埃里希氏体16S rRNA、dsb和gp36基因相关引物对蜱虫基因组DNA进行PCR鉴定,共发现10组阳性样品,经遗传进化分析发现,阳性样品属于3个种:E.ruminantium(2组)、E.muris(2组)和E.canis(6组)。内蒙古自治区阳性率为0%(0/54);黑龙江省阳性率为0.7%(1/144);吉林省阳性率为4.1%(3/74);浙江省阳性率为0%(0/8);海南省阳性率为28.6%(6/21)。2、E.canis抗体检测间接ELISA方法的建立及初步应用本研究利用大肠杆菌表达E.canis P30蛋白,以此为包被抗原建立了E.canis抗体检测间接ELISA方法。并采用该方法对来自我国北京市、上海市、吉林省、辽宁省和江西省的172份犬血清样品进行检测,5省市犬血清样品平均感染率为26.74%。随后,选取本研究所建立间接ELISA方法检测为埃里希氏体抗体阳性的犬血清33份,阴性血清37份,采用美国IDEXX公司的SNAP*4Dx*PLUS试剂盒再次进行检测,两者符合度为92.86%(κ=0.856)。综上,本研究建立的E.canis抗体检测间接ELISA方法与商品化试剂盒符合度较高,可用于临床样品的检测,为犬埃里希氏体病的诊断提供了技术支持。3、E.canis嵌合VLPs的构建及免疫原性研究本研究利用昆虫-杆状病毒表达系统,采用E.canis gp36全长替换NDV HN蛋白胞外域的策略,与NDV M蛋白形成嵌合病毒样颗粒cVLPs-HNcgp36。经Western blot鉴定,蛋白表达正确。透射电镜下,可见直径80-200nm的病毒样粒子。随后采用腹腔注射的方式对C57BL/6小鼠进行免疫,通过检测小鼠体液免疫和细胞免疫水平,对其进行免疫原性分析。结果显示,体液免疫方面,cVLPs-HNcgp36组与可溶性蛋白组相比能够诱导更高的抗体滴度;细胞免疫方面,cVLPs-HNcgp36组CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+T淋巴细胞比例均显著高于其他三组。综上,本研究所构建的嵌合病毒样颗粒cVLPs-HNcgp36与可溶性蛋白相比有着更好的免疫原性,为E.canis新型疫苗的研制提供了新的策略。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.4

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