鸭坦布苏病毒的分离鉴定与免疫原性评价

发布时间：2020-06-12 20:25

【摘要】：自2010年鸭坦布苏病毒病暴发以来,在我国大规模流行,给养殖业造成了巨大的经济损失。在此情况下,迫切需要安全有效的疫苗对其流行进行控制和预防。为此,本研究进行了一些初步探索:1鸭坦布苏病毒的分离与鉴定本研究对广西某鸭场有产蛋下降症状的蛋鸭病料进行病毒分离和鉴定。取卵巢、脾脏和肝脏匀浆后接种BHK-21细胞,盲传3代后产生CPE;用双层噬斑法对分离株进行纯化,连续3次后获得纯化的病毒。该病毒没有血凝性,经RT-PCR鉴定为DTMUV,命名为GX-15株。病毒在BHK-21细胞中培养,滴度最高可达10~(7.0) TCID_(50)/0.1 mL。病毒能适应鸭胚增殖,随着鸭胚传代次数增加,病毒滴度有所升高。对分离株E基因进行测序与分析,与马来西亚分离株MM1775同源性为89%,与国内分离株HZ-2014同源性达96.9%;与黄病毒属其他部分成员的同源性在53.7%-75.2%之间。系统进化分析发现,GX-15分离株与国内分离株HZ-2014处于一个独立小分支,而这两者与马来西亚株MM1775处于同一分支。2间接ELISA方法的建立用无血清培养的GX-15分离株作为抗原,建立了检测DTMUV抗体的间接ELISA方法,经过对条件的优化,确定了抗原包被量是5×10~(3.8)TCID_(50)/孔,血清稀释度为1:200,羊抗鸭二抗稀释倍数为1:4000,二抗作用45min,显色是10min,阴阳临界值为0.463。用该方法检测NDV、AIV(H9)、DHAV-1、DPV、MDRV、DRV等阳性血清,结果均低于0.463,表明该方法具有良好的特异性;其敏感性可达1:1600;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均小于10%,表明该方法稳定性很好。3樱桃谷鸭感染模型的建立用56只60日龄无DTMUV感染的樱桃谷鸭建立了感染模型。将它们随机分成7组,每组8只,分别感染不同剂量的GX-15分离株,对照组注射PBS。感染后仅有10~(6.0)TCID_(50)感染剂量组和10~(5.0)TCID_(50)感染剂量组出现不同程度的采食下降和排深绿色稀便。病理剖检与组织病理学观察结果均为脾脏出现病变,随着感染剂量的降低,病变逐渐减轻,直至消失。感染后第2天,10~(6.0)TCID_(50)、10~(5.0)TCID_(50)、10~(4.0)TCID_(50)、10~(3.5)TCID_(50)感染剂量组血清病毒分离率均为8/8,10~(2.5)TCID_(50)、10~(1.5)TCID_(50)感染剂量组分别为7/8和3/8;感染后第4天每组病毒分离率分别为2/8、3/8、3/8、2/8、1/8;感染后第6天和第8天各组均未分离到病毒。通过分析确定60日龄樱桃谷肉鸭感染模型的感染剂量是10~(3.5)TCID_(50)。4 GX-15分离株免疫原性评价本研究分别对利用细胞和鸭胚培养的病毒,进行灭活工艺研究。结果表明细胞毒灭活条件为:甲醛终浓度0.1%,37℃灭活20 h;鸭胚毒灭活条件为:甲醛终浓度0.1%,37℃灭活24 h。利用GX-15分离株分别制备细胞苗和鸭胚苗,评价其免疫原性。疫苗免疫核酸和抗体均为阴性的樱桃谷鸭后14天进行加强免疫,二免后第28天进行病毒感染评价免疫攻毒保护效果。结果显示,细胞苗和鸭胚苗均能诱导鸭产生高水平的抗体,二免后第14天趋于稳定,第21天两组抗体均达到最高值,两种疫苗的免疫攻毒保护率均不低于7/10,表明分离株具有良好的免疫原性。本研究为DTMUV疫苗的开发奠定了基础。
【图文】：

图 2-1 病毒分离结果Fig.2-1 The results of virus isolationA：正常细胞；B：BHK-21 细胞病变A：BHK-21 cells; B：The CPE of BHK-21病毒的纯化过三次双层噬斑试验得到纯化的病毒。第一次纯化噬斑大小不一（图 2-5 A），从

图 2-5 病毒噬斑纯化A. 第一次双层噬斑试验 10-3倍稀释孔; B. 第二次双层噬斑试验 10-4倍稀释孔;C. 第三次双层噬斑试验 10-4倍稀释孔; D. 对照Fig.2-5 The results of virus plaque purificationA. The 10-3dilution of the first plaque purification; B. The 10-4dilution of the second plaque purification;C. The 10-4dilution of the third plaque purification
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.32

【参考文献】

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本文编号：2710068