2.3.4.4分支H5亚型禽流感病毒样颗粒（VLP）的制备及其免疫原性研究

发布时间：2020-06-13 03:53

【摘要】：H5亚型高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza,HPAI)是严重危害世界养禽业的一种重要疫病,同时,给社会公共卫生安全造成严重威胁。目前,我国流行H5亚型HPAIV主要是2.3.4.4分支。利用SPF鸡胚生产H5亚型HPAI疫苗存在操作环境条件要求高、鸡胚来源受限、生物安全性相对较差等缺点。本研究利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统,成功构建了2.3.4.4分支HPAI病毒样颗粒(Virus-Like Particle,VLP),并研究其免疫原性,旨在为病毒样颗粒疫苗研发提供了理论依据。1.构建THX4#-HA、THX4#-NA、THX4#-M1重组杆状病毒载体质粒。采用RT-PCR方法扩增2.3.4.4分支HPAIV HA、NA和M1 3个基因片段,分别克隆至pFastBac1载体,通过双酶切、测序鉴定,成功获得pFastBac1-THX4#-HA、pFastBac1-THX4#-NA、pFastBac1-THX4#-M1质粒,转化至DH10Bac细胞转座形成重组杆状病毒载体质粒。2.VLP包装和鉴定。将上述重组杆状病毒载体质粒共转染至sf9昆虫细胞,采用血凝(HA)试验、SDS-PAGE、Western Blot、透射电镜观察等方法鉴定VLP表达。结果表明转染后5 d,细胞出现皱缩、变形、融合、囊泡化等特征性病变;病毒扩增至第3代,细胞上清血凝HA效价达到6Log2;HA、NA、M1 3个目的基因成功表达;电镜下观察到直径80~120 nm有囊膜的禽流感VLPs。3.VLP免疫原性研究。SPF鸡二免后15 d,利用ELISA方法检测其血清IgG1、IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ含量,同时采用HI试验、中和试验检测血清抗体水平。结果表明,血清H5亚型禽流感病毒HI抗体效价最高达到10Log2;VLP免疫血清对相同分支毒株中和抗体滴度为2~(-7.15),对其它分支毒株中和抗体滴度为2~(-6.85)。VLP疫苗免疫组血清IL-4、IFN-γ、IL-10含量显著高于阴性对照组(P0.05),IgG1、IL-2含量均高于阴性对照组。综上所述,本研究成功构建由2.3.4.4分支H5亚型HPAIV HA、NA和M1蛋白组装的VLP,其具有良好的免疫原性。本研究将为2.3.4.4分支H5亚型禽流感新型候选疫苗研发及该病的有效防控奠定坚实基础,为保证养禽安全生产提供了条件。
【图文】：

重组质粒,基因扩增,片段,抗性

图 2-1 THX4#-HA，THX4#-NA，THX4#-M1 RT-P2-1 RT-PCR amplification of THX4#-HA, THX4#-NAHA 基因扩增片段；2：NA 基因扩增片段；3：M1M：DNA 分子质量标准fragment; 2: NAgene fragment; 3: M1 gene fragment;质粒鉴定斑筛选原理获得阳性菌落，以 AMP+抗性 LT4-HA、T4-NA、T4-M1；以重组质粒 T4-HA引物 HA-BamHⅠ-F&HA-EcoRⅠ-R、NA-X-F&M1-EcoRⅠ-R 分别扩增 HA、NA、M1 基条带大小分别约为 1.7 kb、1.4 kb、760 bp，基因片段。如图 2-2 所示。重组质粒测序结1 2 3 M（b

重组质粒,双链,载体,片段

增片段；2：T4-HA 基因扩增片段；3：T4-M1 基因扩M：DNA 分子质量标准。ne fragment; 2: T4- HA gene fragment; 3: T4-M1 gene fragM: DNA Marker DL2000.酶切结果T4-HA、T4-NA、T4-M1 是否构建成功的重要检切。pGEM-Teasy 载体连接酶常用于催化双链 D的连接反应，也能催化双链 RNA 5'-磷酸末端和功会出现载体条带和目的条带，因质粒酶切不下需要加适量的限制性内切酶和模板。本试验经结果，如图 2-3，pGEM-Teasy 载体大小约为 300为 1.7 kb、1.4 kb、760 bp，，与预期的结果一致，M1 M2 M31 2 30
【学位授予单位】：河北工程大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.4

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