两株林麝源铜绿假单胞菌生物学特性及胞外产物特性研究

发布时间：2017-03-28 02:08

  本文关键词：两株林麝源铜绿假单胞菌生物学特性及胞外产物特性研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：林麝化脓性肺炎是一种由铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)感染引起的以呼吸困难、鼻孔脓液流出为主要特征的慢性疾病。本试验旨在研究从患化脓性疾病的林麝体内分离的两株铜绿假单胞菌(SP-N和SP-Q)的生物学特性、在单独和1：1共同培养情况下的培养性状以及其胞外产物的生物特性及理化性质,为临床上对该疾病的诊疗和防疫提供理论依据。对SP-N和SP-Q进行常规细菌学鉴定和16S rRNA鉴定,发现2株菌均为革兰氏阴性,其中SP-N为中长杆菌,不产生绿色色素；SP-Q为短杆菌,产生绿色色素。经16S rRNA目标片段测序并与NCBI比对,发现SP-N和SP-Q与P.Aeruginosa的的同源性在99%以上。血清型分型显示,SP-N为铜绿假单胞菌G型,SP-Q为铜绿假单胞菌B型。SP-N、SP-Q及SP-N和SP-Q(按1：1)在37℃普通肉汤培养基中培养,其生长曲线基本一致。单独培养时,SP-N在14 h时活菌数最高,为5.6×10~10 CFU/mL; SP-Q在12 h时活菌数最高,为1.4×10~10CFU/mL;1:1比例共同培养时,在12h时活菌数最高,为1.0×10~10CFU/mL.用12 h的SP-N和SP-Q单独培养液及按1：1共同培养的SP-N和SP-Q培养液接种小鼠,其半数致死量分别为5.05×106CFU/mL、5.22 × 108 CFU/mL和3.57×108 CFU/mL,且两两之间半数致死量差异显著(P0.05),说明SP-N的培养液对小鼠有较强致病性,而共同培养并未增强致病性。经平板玻璃纸法提取铜绿假单胞菌SP-N和SP-Q的胞外产物(extracellular products,ECP),测得SP-N的ECP蛋白浓度为0.8mg/mL, SP-Q的ECP蛋白浓度为0.36mg/mL.通过SDS-PAGE对ECP的蛋白进行分析,发现SP-N和SP-Q的ECP蛋白条带基本一致,主要有7个蛋白条带,其分子量分别为19kDa、23kDa、37 kDa、 42 kDa、52 kDa、 59 kDa和66 kDa。用制备的鼠抗SP-N血清对2菌株的ECP进行印迹杂交,结果显示SP-N的ECP免疫反应条带主要有2条,分子量约为42 kDa和66kDa。 SP-Q的ECP免疫反应条带主要有1条,分子量约为42 kDa。采用杯碟法对ECP的蛋白活性进行分析,发现SP-N和SP-Q的ECP均具有蛋白酶、明胶酶及脲酶的活性和溶血毒性；无卵磷脂酶、脂肪酶、淀粉酶和DNA酶活性。通过固体培养和液体培养观察可见,SP-N不产生绿脓菌素,SP-Q产生绿脓菌素。将SP-N和SP-Q的培养液经氯仿萃取,用分光光度法测得其绿脓菌素的含量分别为0和12.9 mg/mL。ECP对小鼠的致病性试验显示,SP-N和SP-Q的ECP对小鼠的LDso分别为2.12 mg/kg和8.73 mg/kg。
【关键词】：林麝 铜绿假单胞菌 共同培养 胞外产物
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 1 前言11-24
• 1.1 林麝研究进展11-14
• 1.1.1 分类与分布11-12
• 1.1.2 人工养麝的现状12
• 1.1.3 麝香12-13
• 1.1.4 林麝的化脓性疾病13-14
• 1.2 铜绿假单胞菌研究进展14-16
• 1.2.1 生长要求及培养特性14
• 1.2.2 流行病学14-15
• 1.2.3 生化特性15-16
• 1.2.4 铜绿假单胞菌分型16
• 1.3 铜绿假单胞菌粘附因子研究进展16-17
• 1.3.1 Ⅳ型菌毛16-17
• 1.3.2 鞭毛17
• 1.3.3 细胞外粘多糖17
• 1.4 铜绿假单胞菌研胞外产物研究进展17-24
• 1.4.1 外毒素A(ETA)18-20
• 1.4.2 外酶(Exo)20-23
• 1.4.3 蛋白酶23
• 1.4.4 磷脂酶C(PLcs)23-24
• 1.4.5 绿脓素24
• 1.5 本研究的目的及意义24
• 2 试验材料24-28
• 2.1 试验菌株24-25
• 2.2 试验动物25
• 2.3 主要试剂和药品25
• 2.4 主要仪器25-26
• 2.5 主要溶液及配制26-28
• 2.5.1 培养基26-27
• 2.5.2 SDS-PAGE及Western-blotting涉及溶液27-28
• 3 试验方法28-34
• 3.1 菌株特性28-29
• 3.1.1 菌株活化28
• 3.1.2 常规细菌学鉴定28
• 3.1.3 16SrRNA鉴定28-29
• 3.1.4 菌株血清型分型29
• 3.2 单独及共同培养特性研究29-30
• 3.2.1 生长曲线的测定29-30
• 3.2.2 培养液的致病性30
• 3.3 胞外产物特性研究30-34
• 3.3.1 提取及含量测定30-31
• 3.3.2 SP-N鼠抗全菌血清制备31-32
• 3.3.3 间接ELISA检测抗SP-N免疫小鼠血清效价32
• 3.3.4 SDS-PAGE和Wester-blotting分析32-33
• 3.3.5 胞外酶活性检测33
• 3.3.6 绿脓素测定33-34
• 3.3.7 小鼠致病性试验34
• 4 试验结果34-44
• 4.1 菌株特性34-37
• 4.1.1 菌株的形态、染色观察34-35
• 4.1.2 生理生化特性观察35-36
• 4.1.3 菌株血清分型36
• 4.1.4 16SrRNA鉴定36-37
• 4.2 单独及共同培养特性研究37-40
• 4.2.1 生长曲线的测定37-38
• 4.2.2 培养液的致病性38-40
• 4.3 胞外产物特性研究40-44
• 4.3.1 含量测定40
• 4.3.2 间接ELISA的方法检测免疫后小鼠血清中抗体水平40-41
• 4.3.3 SDS-PAGE和Wester-blotting分析41-42
• 4.3.4 胞外产物酶活性分析42-43
• 4.3.5 绿脓素测定43-44
• 4.3.6 胞外产物对小鼠致病性试验44
• 5 讨论44-48
• 5.1 菌株特性44-45
• 5.2 单独及共同培养特性研究45-46
• 5.3 胞外产物特性研究46-48
• 6 结论48-49
• 7 创新性49-50
• 参考文献50-60
• 致谢60

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本文编号：271498