胞内劳森菌LS1087和LS1136蛋白的表达及其单克隆抗体的制备及应用

发布时间：2020-06-16 02:21

【摘要】：猪回肠炎(全称猪增生性回肠炎porcine proliferative enteropathy,PPE)是由胞内劳森菌(Lawsonia intracellularis,LI)引起的一种以回肠及盲肠结处近端的结肠、盲肠黏膜呈腺瘤增生为主要特征的肠道疾病。胞内劳森菌主要损害猪的肠道,严重影响猪的料肉比。胞内劳森菌基因组达170多万个碱基对,有1324个蛋白编码区,尽管有些蛋白如LsaA蛋白、LatA蛋白和LhlyA蛋白被报道,还有许多蛋白未被研究,LS1087蛋白是胞内劳森菌的假定膜蛋白,LS1136蛋白是胞内劳森菌的假想蛋白,本研究从回肠炎阳性病料提取DNA,通过PCR、质粒构建和原核表达得到了LS1087和LS1136蛋白,通过杂交瘤技术制备了针对两种蛋白的单抗,为胞内劳森菌的进一步研究奠定了基础。1.LS1087蛋白和LS1136蛋白原核表达根据GenBank中胞内劳森菌全基因序列(AM180252.1)设计引物,从回肠炎阳性病料中提取DNA,通过PCR获得LS1087基因片段和LS1136基因片段。将LS1087基因片段和LS1136基因片段克隆至原核质粒pET-32a和pGEX-4T-1,获得重组质粒pET-32a-LS1087、pGEX-4T-1-LS1087、pET-32a-LS1136和pGEX-4T-1-LS1136。将重组质粒转化至表达菌株,并表达了融合蛋白LS1087-His、LS1087-Gst、LS1136-His和LS1136-Gst,SDS-PAGE电泳结果显示:融合蛋白主要以包涵体形式存在,融合蛋白LS1087-His、LS1087-Gst、LS1136-His、和LS1136-Gst大小分别为38 kDa、44 kDa、55 kDa和64 kDa。使用镍柱纯化LS1087-His和LS1136-His蛋白,使用DTT、DOC(脱氧胆酸钠)和SKL等试剂纯化LS1087-Gst和LS1136-Gst蛋白,结果LS1087-His和LS1136-His蛋白比LS1087-Gst和LS1136-Gst蛋白纯化效果好。2.抗LS1087蛋白和LS1136蛋白单克隆抗体的制备将LS1087-Gst和LS1136-Gst蛋白混合作为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,将LS1087-His和LS1136-His蛋白混合作为检测抗原,经ELISA方阵滴定和间接ELISA确定抗体水平最高的小鼠,采用杂交瘤技术,成功筛选到5株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为7E9、9D8、15H10、16A1和16G10。ELISA实验和Western blotting实验结果显示:7E9和9D8抗LS1087蛋白,15H10、16A1和16G10抗LS1136蛋白。单抗特异性试验结果显示:5株单抗与其他9种细菌超裂液未出现明显的交叉反应。免疫组化试验表明:5株单抗均能特异性结合胞内劳森菌。目前,国内未见制备抗胞内劳森菌蛋白单克隆抗体的报道,本研究制备抗胞内劳森菌蛋白单克隆抗体,并成功获得了5株能特异性结合胞内劳森菌的单抗,这5株单抗可作为劳森菌分离或检测的工具,为今后进一步的研究打下了基础。
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61
【图文】：

与 LS1087 基因预期大小相符（图 2.1）。.1.2 重组克隆菌的菌落 PCR 鉴定pET-32a-LS1087 重组菌 PCR 结果显示，随机挑约 615 bp 左右的单一条带（图 2.2）。M：DNA 1：LS1082：阴性对M:DNA M1:The ampLS1087 fra2:Negativ图 2.1 LS1087 基因 PCR 扩Fig 2.1 The PCR amplified produc

.3.1.3 重组表达菌的菌落 PCR 鉴定pET-32a-LS1087 重组表达菌 PCR 结果显示，大小约 615 bp 左右的明显条带（图 2.4）。图 2.3 PCR 鉴定 pGEX-4Fig2-3 Colony PCR analysis of the Trans5α

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本文编号：2715380