1950-2009年动物源沙门菌的分型、耐药性及致病性研究

发布时间：2020-06-17 17:25

【摘要】：沙门菌(Salmonella)是全球范围内常见的食源性致病菌,可广泛感染哺乳类、鸟类、爬行动物、两栖动物等。人类可由多种途径感染,其中通过畜禽产品是最主要的感染途径。沙门菌分型复杂,目前仅根据血清型方法可初步分为近2600种血清型,但由于分型血清价格较高、影响分型试验的因素多,其应用于揭示病原菌之间关系时存在较大缺陷。随着分子生物学发展,将血清分型与分子分型相结合可极大提高对沙门菌分型的准确性。随着抗菌药物的应用,在抗生素的选择压力下,沙门菌耐药菌株不断增多,超级耐药菌株的发现更给公共卫生提出了新的挑战。本文研究了我国1950～2009年间60株动物源沙门菌分离株的血清型、MLST分型分布情况,并对样品进行了耐药性检测和致病性研究,建立了相应的基础数据库,为沙门菌的检测、追踪溯源和防控提供基本信息。(1)本研究中60株动物源沙门菌,其中鸡源分离株33株(55%),猪源分离株25株(41.67%),马源分离株2株(3.33%);血清型分型共分为7个血清型,其中猪霍乱沙门菌(Salmonella choleraesuis)、肠炎沙门菌(Salmonella Enteritidis)和鸡白痢沙门菌(SalmonellaPullorum)三种血清型分离率位于前三位,分别占总菌株数的31.67%(19/60)、26.67%(16/60)和21.67%(13/60),其余鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium)、马流产沙门菌(Salmonella Abortusequi)、田纳西沙门菌(Salmonella Tennessensis)和印第安纳沙门菌(Salmonella Indiana)分别为 10%(6/60)、3.33%(2/60)、3.33%(2/60)和 3.33%(2/60)。血清型具有明显的时代特征,1950-1969年猪作为畜牧业中主要的养殖动物所受重视程度较高,分离的沙门菌血清型以猪霍乱沙门菌为主(12/20),而鼠伤寒沙门菌(2/20)、鸡白痢沙门菌(4/20)和肠炎沙门菌(2/20)均有分离;1970-1989年分离的沙门菌血清型猪霍乱沙门菌(7/20)与鸡白痢沙门菌(7/20)比例相同,除鼠伤寒沙门菌(4/20)外,还分离到了马流产沙门菌(2/20);1990-2009年我国畜禽养殖出现了集约化养殖的趋势,分离的沙门菌绝大多数是禽源沙门菌,血清型主要是肠炎沙门菌(14/20),此外还分离到田纳西沙门菌(2/20)和印第安纳沙门菌(2/20)。MLST分型共有9个ST型,ST68、ST11、ST92所占比例较高,分别为30%(18/60),26.67%(16/60)和15%(9/60),其余各菌株ST 型所占比例为 ST19:10%(6/60)、ST132:6.67%(4/60)、ST17、ST251和 ST319 均为3.33%(2/60)、ST139:1.67%(1/60)。MLST分型结果与血清型分型结果对应性良好,ST11为肠炎沙门菌、ST17为印弟安那沙门菌、ST92和ST132为鸡白痢沙门菌、ST319为田纳西沙门菌、ST68和ST139为猪霍乱沙门菌、ST19为鼠伤寒沙门菌、ST251为马流产沙门菌。此外试验结果显示MLST分型能力要略高于血清学分型方法,可以一定程度的区分分离株,在同一血清型内不同分离株间进一步分析其系统进化和亲缘关系。(2)本研究中沙门菌样本对氨苄西林(AM)、多西环素(DOX)、四环素(TE)和磺胺异恶唑(SF)药敏试验结果呈现双峰式分布,耐药菌株与敏感菌株MIC分布相对集中;超过30%的菌株对多黏菌素(CL)低敏,所有菌株对美罗培南(MEM)高敏。由于阿莫西林/克拉维酸(A/C)、庆大霉素(GM)、大观霉素(SPF)、氧氟沙星(OFL)、恩诺沙星(ENR)和复方新诺明(SXT)这6种抗生素的抑菌效果较好,其耐药菌株比例均小于5%,头孢噻呋(CEF)、氟苯尼考(FFC)和头孢他啶(CAZ)的抑菌效果稍弱,分别有11.67%、8.33%和6.67%的菌株对其耐药。按照菌株分离时间统计,1950-1959年间分离的沙门菌对药物敏感性很高,仅有1株细菌对DOX处于中介值,其余菌株对15种抗生素均敏感;1960-1969年间菌株对CAZ、GM、SPF和CL敏感的菌株有所减少,有4株菌株对SPF处于中介值,有2株分离株对CL耐药;1970-1989年间分离的沙门菌对DOX、GM、SPF和CL均有耐药菌株的产生,总体上处于中介值以上的菌株数量上与60年代差别不大;1990-1999年间,沙门菌耐药性突然增强,超过50%的菌株对AM、TE、SF和CL产生了耐药性,60%的菌株对ENR的药敏性处于中介值;2000-2009年间分离的沙门菌株中,超过了 50%的菌株对AM、SF、TE、DOX、CL和CEF产生耐药性,并且对除美罗培南外的14种抗生素均有耐药菌株的产生。本研究中有23株沙门菌对抗生素耐药,其中5株沙门菌仅对1种抗生素产生耐药性;18株沙门菌对2种及以上抗生素产生耐药性;4重、5重耐药菌株所占比例较大,分别有9株(50%)、6株(33.33%)。对抗生素耐药谱分析共有12个耐药谱,其中AM-TE-DOX-SF为主导耐药谱,所占比例为22.22%,50%的沙门菌仅有1种耐药谱。根据菌株分离时间分析其耐药谱,1990年代主导耐药谱为AM-TE-SF-CL和AM-TE-DOX-SF,2000年代主导耐药谱为AM-TE-DOX-SF-CL,其次为AM-TE-DOX-SF。综合分析各耐药谱发现,共有12株沙门菌含有AM-TE-SF耐药组合,占所有多重耐药菌株的66.67%,该组合应已成为一个固定耐药谱。本研究针对磺胺类、β-内酰胺类、氨基糖苷类、氯霉素类、四环素类和喹诺酮类的耐药基因分别应用14对引物进行检测,其中sul2、blaTEM和tet(A)等3种耐药基因检出量较高,分别占被检样品的76.19%、71.43%和61.90%,aac(6)-1b和floR占23.81%,aacC4和t t(G)占 19.05%,blaOX4 占 14.29%,blaCMY、blaPSE、blaSHV、catA1、qnrA 和qnrB等6种基因未被检出,耐11种以上的两种耐药菌均检出携带有blaOXA、aacC4、aac(6)-1b、floR和tet(A),此基因组合可能是其成为超级耐药克隆的主要原因。(3)本研究中选用ICR小鼠作为实验动物,建立统一的动物模型,可快速对不同动物源的沙门菌致病性进行比对。根据研究结果,60株沙门菌对ICR小鼠ID50的致病菌量主要集中于107CFU,占总菌株的41.67%,1960-1989年分离菌株ID50致病菌量集中在108CFU,占该时间段分离菌株的50%,2000-2009年间分离的沙门菌毒力最强,ID50中位数为1.41×107,1960-1969年分离的沙门菌毒力最弱,中位数为12.28×107,比较各年代沙门菌菌株间标准差发现其波动幅度较大,表明不同年代菌株间致病性差异明显。研究不同血清型沙门菌的致病性发现,印第安纳沙门菌致病最强,ID50为106CFU,其次为鼠伤寒沙门菌和肠炎沙门菌,ID50为107CFU,猪霍乱沙门菌、鸡白痢沙门菌、马流产沙门菌和田纳西沙门菌ID50为108CFU。相同血清型不同菌株比较,鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、田纳西沙门菌和印第安纳沙门菌各菌株ID50相近,猪霍乱沙门菌、鸡白痢沙门菌和马流产沙门菌差异显著;分析沙门菌ST型与致病性关系,ST139致病性最强,ID50为4.4×106 CFU,其次为 ST17 菌株,ID50 菌量为 9×106CFU,ST19、ST11 和 ST92 菌株.ID50 菌量为 107CFU,ST68、ST132、ST251 和 ST319 的 ID50 菌量为 108CFU。比较各 ST 型菌株致病性标准差,ST19、ST11、ST132、ST17和ST319 5种ST型菌株标准差均小于5,菌株间致病性差异不显著,ST68、ST92和ST251标准差约等于10,差异显著。以上结果表明致病性与血清型/ST型存在相互对应关系,血清型/ST型不同,致病性也有差异,同型菌株间的差异程度与致病性强弱无关,仅与型特异性相关。本研究中共22株沙门菌具有耐药性,其中1株超级耐药菌(耐药种类12种)致病性最强,ID50为7×105CFU,其他多重耐药菌株(耐药种类2)ID50的Med均在107 CFU,1株双重耐药的菌株ID50为1.2×109 CFU,其余仅对一种抗生素有耐药的菌株的ID50为108CFU。基于本研究,我们推断沙门菌耐药性增强能够促进其致病性。结论:(1)研究中60株动物源致病性沙门菌共有7个血清型9个ST型,血清学分型结果与MLST分型结果进行对应比较,大多ST型均可与血清型有比较固定的对应关系,沙门菌分型结果与分离年代有明显相关性。(2)样本中对AM、TE、DOX、SF和CL等五种抗生素产生耐药性的菌株分离率较高,形成一个AM-TE-SF耐药谱(分离率为66.67%)。耐药基因检测方面,blaTEM、sul2和tet(A)等3种耐药基因检出量较高。(3)沙门菌致病性为型特异性特征,仅与沙门菌的血清型/ST型相关。耐药性与致病性关系有待进一步研究证实。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61
【图文】：

氨苄西林,药敏试验,耐药性

３．１．砂内酰胺类药物药敏试验结果逡逑通过药物敏感性试验分析各年份沙门菌对斤内酰胺类药物的药敏性，１９５０－２００９年间分逡逑离的沙门菌对美罗培南敏感性最高（图２．５），全部菌株均敏感无耐药菌株产生．其次为阿莫逡逑西林／克拉维酸（图２．２），产生了邋３株耐药菌株和１株中介菌株；头孢噻呋和头孢他啶的药逡逑敏性相对较低（图２．３、２．４），分别有７株和６株耐药菌产生；敏感性最低的是氨苄西林（图逡逑２．１），３０％的菌株均对其有耐药性。分析各年份菌株对药物的敏感结果发现，耐药菌株均逡逑出现在１９９０－２００９年间，且动物源沙门菌对第三代头孢类药物的耐药性产生极为迅速，逡逑１９８０－８９年间分离菌株对第三代头孢药物尚无耐药性，１９９０－９９年间分离株对第三代头孢药逡逑物己有１０－２０％的菌株具有了耐药性，而到了邋２０００－０９年，５０％的分离株均对第三代头孢药逡逑物产生了耐药性，与１９９０ｓ相比增长了邋３０个百分点。逡逑１２邋．逡逑：逦＇Ｉ邋Ｉ逦＂１逡逑Ｉ８逦W邋Ｕ逡逑Ｊ逦｜逦Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ逡逑W逡逑Ｓ邋Ｉ邋Ｒ逦Ｓ邋Ｉ邋Ｒ逦Ｓ邋Ｉ邋Ｒ逦Ｓ邋Ｉ邋？逦Ｓ邋Ｉ邋Ｒ逦Ｓ邋！邋Ｒ逡逑１９５０－１９５９逦１９６０－１９６９逦１９７０－１９７９逦１９８

药敏试验,头孢噻呋,沙门菌

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【参考文献】