单增李斯特菌lmo2193基因缺失株的构建及其部分生物学特性研究

发布时间：2020-06-18 08:37

【摘要】：单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种胞内致病菌,主要感染免疫功能低下的个体,可致败血症、脑膜炎、胎儿感染或流产等。寡肽转运蛋白(Oligeopeptide transporter,Opp)是寡肽转运系统中运送胞内生长所必需的氨基酸及调控细菌毒力的一类蛋白质。在基于利用泛基因组技术对LM的研究中,首次发现lmo2193基因具有Opp活性,但其具体功能尚未知。本研究以新疆绵羊脑炎临床分离株LM90SB2为研究材料,对lmo2193基因进行克隆、生物信息学分析及原核表达后通过重叠延伸PCR与同源重组技术构建lmo2193基因缺失株及回补株,并将缺失株分别与野毒株、回补株进行比较,分析其环境适应性、生物被膜形成能力、细胞粘附侵袭性、胞内增殖毒力影响等探究lmo2193基因作为Opp在LM中的功能及其对致病性的影响。目的:(1)生物信息学分析推测LM90SB2菌株lmo2193基因功能。(2)构建该基因的缺失株及回补株。(3)研究该基因缺失对LM环境适应性及生物被膜形成能力的影响。(4)研究该基因缺失对LM毒力的影响。方法:(1)PCR扩增lmo2193基因,克隆测序,进行生物信息学分析,并表达该蛋白,用SDS-PAGE凝胶电泳与Western Blot技术鉴定。(2)PCR扩增上下游臂,利用重叠延伸PCR扩增融合片段,与穿梭质粒pKSV7连接,电转至野毒株感受态中筛选阳性转化子,双重压力传代培养筛选基因缺失株;将该基因与整合型质粒pIMK2连接,电转至缺失株感受态中筛选基因回补株;检测遗传稳定性。(3)在不同环境压力条件下对缺失株与野毒株、回补株的生长曲线及不同时间段生物被膜形成进行比较。(4)分别利用缺失株、野毒株、回补株感染不同来源的细胞,对细胞粘附、侵袭性及胞内增殖能力进行比较;感染小鼠,检测LD_(50)及比较肝脏、脾脏、脑组织载菌量的差异。结果:(1)生物信息学分析显示:lmo2193蛋白为ATP超家族,推定该基因为oppD;原核表达该基因,获得60 kDa左右的融合蛋白,与预期一致。(2)成功构建了具有良好稳定遗传性的缺失株LM90SB2ΔoppD及回补株CLM90SB2ΔoppD。(3)在不同温度、EtOH浓度、pH、NaCl浓度条件下LM90SB2ΔoppD比LM90SB2、CLM90SB2ΔoppD生长缓慢;LM90SB2ΔoppD的网格密集程度与生物被膜形成量均低于LM90SB2、CLM90SB2ΔoppD。(4)LM90SB2ΔoppD对四种细胞的粘附及侵袭率相比LM90SB2、CLM90SB2ΔoppD均有所下降;在SIEC细胞内,三株细菌增殖量均逐渐减少,而在RAW264.7、MBMEC和HBMEC,菌量均呈逐渐增多趋势;小鼠实验中,LM90SB2ΔoppD的毒力水平较LM90SB2、CLM90SB2ΔoppD分别提高了1.34、0.5个数量级;LM90SB2ΔoppD在各组织载菌量均低于LM90SB2与CLM90SB2ΔoppD。结论:(1)推定LM90SB2菌株lmo2193基因功能为OppD。(2)成功构建了稳定遗传性的缺失株LM90SB2ΔoppD及回补株CLM90SB2ΔoppD。(3)LM90SB2菌株lmo2193基因的缺失会使其环境适应性及生物被膜形成能力降低。(4)LM90SB2菌株lmo2193基因缺失会使其毒力下降。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61
【图文】：

Opp基本结构示意图（A）及操纵子（B）示意图（引自张伟欣）

1-1 lmo2193 基因 PCR 扩增结果CR amplification results of lmo2193 gene DNAMarKer；1：lmo2193 基因 PCR 扩果；2：hly 基因鉴定；3-4：空白000 DNAMarKer; 1: PCR products of3 gene; 2: Identification of hly gene; 3-4:图 1-2 pMT19T-2193 重组质粒Fig.1-2 Identification of recompMD19T-2193 by enzymM: 2 000 DNAMarKer；1：pM切产物； 2：pMD19M: 2 000 DNAMarKer; 1: pM

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本文编号：2718986