猪伪狂犬病病毒HeN1株gB蛋白单克隆抗体制备及B细胞线性表位鉴定

发布时间：2020-06-19 02:16

【摘要】：伪狂犬病(Pseudorabies)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的各种家畜及野生动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为特征的急性传染病。该病自1947年传入我国,通过疫苗免疫疫情基本呈稳定状态。2011年以后,以HeN1株为代表的变异株在全国多个地区爆发流行,原有疫苗不能对猪群提供完全保护,这对伪狂犬病的监控及病原结构的研究提出了新的要求。猪伪狂犬病毒gB糖蛋白具有很好得保守性,通过检测gB蛋白可以反映猪群的抗体水平。本实验目的是制备抗PRV gB蛋白的单克隆抗体并鉴定其抗原表位。以超离纯化的PRV HeN1株全病毒为抗原免疫6周龄BALB/c小鼠,取免疫后血清抗体呈阳性的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,用免疫荧光的方法(IFA)筛选阳性杂交瘤细胞,经过4次亚克隆获得一株稳定分泌抗PRV gB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E7。Western blot结果表明,1E7细胞分泌的单克隆抗体与PRV全病毒和真核表达的gB蛋白均能反应。抗体亚类鉴定1E7细胞分泌的单抗重链属于IgG2b亚类,轻链为kappa链。ELISA试验显示1E7细胞分泌的单抗与PRV的结合可以被猪阳性血清阻断。杂交瘤细胞培养上清和制备的腹水中抗体的IFA效价分别为1:160和1:12800。利用大肠杆菌原核表达系统,表达一系列gB截短蛋白,最终确定1E7细胞分泌的单抗识别的抗原表位是S~(81)AEESLE~(87),且此表位在各PRV毒株间相对保守。本单克隆抗体的成功制备为PRV抗体检测方法的建立及gB蛋白的结构和功能研究提供了实验材料。
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.651
【图文】：

病毒,单克隆抗体,犬病,红外荧光

犬病病毒 HeN1 株 gB 蛋白单克隆抗体制5-20 min，加入 2M H2SO4，50 μL/孔纯化后的 PRV HeN1 蛋白浓度为 2 Vero 细胞培养上清 100 倍稀释后N1 gE单克隆抗体和兔抗鼠红外荧光 PRV HeN1 为抗原的泳道，在 120V HeN1 病毒能被 PRV HeN1 病毒 M 1 2kDa

小鼠血清,免疫后

2.3.3 杂交瘤细胞株的筛选对上述血清抗体含量高的小鼠进行加强免疫，三天后取加强免疫后的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 以 PEG 为融合剂对两种细胞进行融合，融合后 14 d 时，细胞长满底部的 1/4，以感染了 PRV HeN1 病毒的 Vero 细胞为抗原经 IFA 方法对细胞培养上清进行第一次筛选，将筛选出的阳性杂交瘤细胞继续用转染了 PCDNA3.1(+) PRV HeN1 gB 质粒的293T 细胞为抗原经 IFA 方法进行第二次筛选，将两次鉴定均为阳性的细胞进行有限稀释法即亚克隆，经过 4 次亚克隆，最终获得一株稳定分泌抗 PRV HeN1 gB 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，将其命名为 IE7，1E7 分泌的单克隆抗体可以特异性识别 PRV HeN1，PRV HeN1gB，如图 2.3。图 2.2 免疫后小鼠血清的 IFA 分析（200×）A-F：免疫后小鼠血清 G：未免疫小鼠血清Fig 2.2 IFAanalysis of mouse serum after immunization（200×）A-F: mouse serum after immunization G: mouse serum without immunization

【参考文献】