MMP9对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的作用研究

发布时间：2020-06-19 11:16

【摘要】：乳腺是精密复杂的分泌器官。乳腺发育的不同阶段需要细胞外基质精细控制的降解和重塑,基质金属蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP9)被认为是其中的关键酶,但是缺乏具体研究。为确定MMP9基因对奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)的作用及可能机理,本研究构建MMP9基因过表达载体,以BMECs作为研究对象,采用基因过表达和基因沉默技术,改变BMECs中MMP9的表达,利用MTT法检测BMECs的细胞增殖情况,利用甘油三酯检测试剂盒检测BMECs的甘油三酯含量的变化,利用细胞划痕实验检测BMECs的迁移情况。并通过Western blotting或qPCR法检测β-酪蛋白及相关信号分子的表达,确定MMP9对BMECs的作用及可能机理;另外分别在BMECs中添加LY-294002、U0126或雷帕霉素,通过Western blotting检测MMP9及相关信号通路分子的表达,以确定各信号通路是否对MMP9基因表达具有调节作用。MMP9基因的过表达和沉默实验结果显示,MMP9基因过表达时可显著上调p-mTOR(P0.05)、mTOR(P0.05)、Bcl-2(P0.05)、Bcl-XL(P0.05)、E-Cadherin(P0.05)的表达;MMP9还可以显著提高细胞增殖能力(P0.05),显著提高BMECs中β-酪蛋白(P0.05)和甘油三酯(P0.05)的合成,并显著促进BMECs迁移,但此时Bax(P0.05)和Bak(P0.05)表达量相对下降;MMP9基因沉默时所有指标均与MMP9基因过表达时相反,推测MMP9基因能促进BMECs增殖和迁移。在BMECs中分别添加信号通路抑制剂后结果显示,LY-294002能显著降低p-AKT(P0.05)、AKT(P0.05)、MMP9(P0.05)的蛋白表达;雷帕霉素能显著降低p-mTOR(P0.05)、mTOR(P0.05)、MMP9(P0.05)的蛋白表达,;U0126能显著降低p-ERK(P0.05)、ERK(P0.05)、MMP9(P0.05)的蛋白表达。推测PI3K/AKT/mTOR和MAPK信号通路能调节MMP9蛋白表达。综上所述,MMP9基因能促进BMECs增殖和迁移;其基因表达可被PI3K/AKT/mTOR和MAPK信号通路调节。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823
【图文】：

结 果上皮细胞的培养与鉴定上皮细胞的原代培养取奶牛乳腺上皮细胞原代细胞。培养约 3-5 天后，在光学显微出，呈长梭型。继续培养 3-5 天后，乳腺上皮细胞开始爬出细胞混合生长。继续培养直至细胞达到 90%以上。利用两种行细胞梯度消化，消化 2-3 次后获得纯的奶牛乳腺上皮细胞后，进行传代处理，用于后续实验。

图 3-2.奶牛乳腺上皮细胞角蛋白 18 鉴定（200×）Fig. 3-2. Expression of cytokeratin 18 in cultured dairy cows mammary epithelial cells（200×3.2 MMP9 基因对奶牛乳腺上皮细胞的作用3.2.1 MMP9 基因过表达对奶牛乳腺上皮细胞的作用3.2.1.1 MMP9 基因过表达质粒的构建及转染将纯化后的 MMP9 DNA进行经 KpnI和 NotI位点的双酶切，与质粒 pcDNA3.1+（5400相连，得到表达载体 pcDNA3.1 -MMP9。表达载体 pcDNA3.1-MMP9 经 KpnI 和 NotI 双切后分别得到清晰的两个条带，分别为 MMP9 基因和载体质粒 pcDNA3.1+，在预期的位出现明显的条带（如图 3-3.第 2 泳道），说明真核表达载体 pcDNA3.1-MMP9 构建成功。序结果与 Genebank 数据库相关序列进行比对，氨基酸无突变，同源性达 100%如图 3-4。

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 崔新洁;王婷;刘秉春;陶林;王潇;;牛奶中乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定[J];生物技术通报;2013年03期

2 崔新洁;胡庆亮;李奕平;陶琳;修磊;刘秉春;陈媛;王潇;;金黄色葡萄球菌诱导牛原代乳腺上皮细胞的凋亡[J];中国农业科学;2013年15期

3 李吉霞;葛秀国;王文秀;张涌;;牛乳腺上皮细胞的分离培养[J];黑龙江畜牧兽医;2012年07期

4 李瑞国;苗朝华;安晓荣;陈永福;;牛乳腺上皮细胞体外分离、培养和鉴定的研究[J];中国农业科技导报;2010年04期

5 宋亚男;陈志伟;刘东武;;牛乳腺上皮细胞体外培养体系研究进展[J];生命科学仪器;2008年09期

6 张骞;顾小卫;;乳腺上皮细胞的研究及应用[J];中国牧业通讯;2008年21期

7 王治国;卜登攀;王加启;;牛乳腺上皮细胞β-酪蛋白的检测及核型分析[J];中国畜牧兽医;2007年02期

8 胡艳秋;谭立新;罗淑萍;牛志刚;李文蓉;;β-酪蛋白基因在不同乳腺上皮细胞中表达的初步分析[J];新疆农业大学学报;2006年02期

9 占今舜;刘明美;詹康;赵国琦;;苜蓿黄酮对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂和乳糖合成的影响[J];中国畜牧杂志;2017年01期

10 邢媛媛;李红磊;李大彪;胡红莲;张兴夫;高民;;油酸对奶牛乳腺上皮细胞内甘油三酯含量和乳脂肪合成相关基因表达的影响[J];中国畜牧杂志;2017年07期

相关会议论文 前10条

1 田甜;李键;毕琳;梁天宇;王中乾;;激素和生长因子对牦牛乳腺上皮细胞生长的影响[A];中国畜牧兽医学会兽医产科学分会第五届全体会议第十次学术研讨会论文集[C];2009年

2 李冬辉;林叶;高学军;王春梅;张莉;李庆章;;催乳素、雌激素和胰岛素对奶牛乳腺上皮细胞中瘦素及其受体的影响[A];全国动物生理生化第十二次学术交流会论文摘要汇编[C];2012年

3 金永成;张晶;牛淑玲;周长海;李洪求;;反式油酸和共轭亚油酸对牛乳腺上皮细胞中蛋白质二硫键异构酶基因表达的影响[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十一次全国动物营养学术研讨会论文集[C];2012年

4 欧阳五庆;钱菊汾;;山羊乳腺上皮细胞培养体系的建立及cAMP对该细胞的影响[A];中国细胞生物学学会第七次会议论文摘要汇编[C];1999年

5 王月影;王艳玲;杨国宇;;乳腺上皮细胞钙转运机制研究进展[A];全国动物生理生化第十次学术交流会论文摘要汇编[C];2008年

6 丁月云;包红朵;周芬;张莉莉;王恬;;黄芪、王不留行对奶牛乳腺上皮细胞体外分泌性能影响的研究[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十次学术研讨会论文集[C];2008年

7 万中英;高学军;佟慧丽;李庆章;;王不留行增乳活性成分对奶牛乳腺上皮细胞信号转导途径的影响[A];全国动物生理生化第十一次学术交流会论文摘要汇编[C];2010年

8 童津津;曲波;高学军;王春梅;张莉;林叶;李庆章;;奶牛乳腺上皮细胞E-cadherin/Beta-catenin的定位及表达[A];全国动物生理生化第十二次学术交流会论文摘要汇编[C];2012年

9 王佳丽;高学军;李庆章;王春梅;张莉;林叶;;蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞亚细胞器蛋白质组学影响[A];全国动物生理生化第十二次学术交流会论文摘要汇编[C];2012年

10 欧阳五庆;;山羊乳腺上皮细胞培养体系的建立[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年

相关重要报纸文章 前1条

1 陆志城;ＡＢＣＧ２“排毒”亦“吸毒”[N];医药经济报;2005年

相关博士学位论文 前10条

1 骆超超;奶牛乳腺上皮细胞Sestrin 2基因在氨基酸调控酪蛋白合成中的作用机制[D];中国农业科学院;2018年

2 霍楠;PURB在氨基酸调节BMECs乳合成中的作用和分子机理[D];东北农业大学;2018年

3 孙雨婷;短链脂肪酸受体GPR41基因在奶山羊乳腺上皮细胞脂代谢中的作用研究[D];西北农林科技大学;2015年

4 张天颖;反10、顺12共轭亚油酸（Trans10,Cis12-CLA）对奶山羊乳腺上皮细胞脂代谢的调控作用研究[D];西北农林科技大学;2018年

5 吴琼;乳酸杆菌减轻大肠杆菌诱发奶牛乳腺上皮细胞炎性损伤的机理[D];中国农业大学;2018年

6 代文婷;SARS介导蛋氨酸调节奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成的机制研究[D];浙江大学;2018年

7 孙宇;重组牛脂多糖结合蛋白对脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞炎症反应的影响及其机制研究[D];南京农业大学;2015年

8 郑月茂;转基因山羊乳腺上皮细胞系建立与转基因克隆胚发育[D];西北农林科技大学;2005年

9 杜娟;奶牛乳腺上皮细胞高温应答机制的研究[D];南京农业大学;2007年

10 刘立新;14-3-3γ调控脂多糖诱导的奶牛乳腺上皮细胞炎症反应和泌乳[D];东北农业大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 孙丽婷;硫化氢对脂多糖诱导奶牛乳腺上皮细胞炎性和自噬的影响及其机制[D];吉林大学;2019年

2 李玉丹;抑制p38MAPK信号通路对热处理奶牛乳腺上皮细胞蛋白差异表达的影响[D];南京农业大学;2017年

3 李媛;腺病毒介导人卵泡刺激素基因在山羊乳腺上皮细胞的表达[D];西北农林科技大学;2019年

4 王希希;LncRNA LRRC75A-AS1对奶牛乳腺上皮细胞的生物学特性及功能的影响[D];西北农林科技大学;2019年

5 赵文苹;LPS刺激奶牛乳腺上皮细胞后外泌体的分离鉴定及miRNA分析[D];黑龙江八一农垦大学;2019年

6 单旭菲;PRL抵抗在LPS导致BMEC乳蛋白合成功能降低中的作用[D];黑龙江八一农垦大学;2019年

7 吕贺;CIDEC对奶牛乳腺上皮细胞中FASN表达的调控研究[D];东北农业大学;2019年

8 汤云飞;MMP9对奶牛乳腺上皮细胞泌乳功能的作用研究[D];东北农业大学;2019年

9 车滟翼;IFN-γ增强奶牛乳腺上皮细胞对金黄色葡萄球菌易感性的机制研究[D];吉林大学;2018年

10 张亚林;不同蛋氨酸源对猪乳腺上皮细胞蛋白质合成的调控及其机制研究[D];四川农业大学;2016年

本文编号：2720714