右美托咪定对LPS致大鼠肝损伤的保护作用及相关机制研究

发布时间：2020-06-21 10:29

【摘要】：内毒素血症是兽医临床上常发生且高死亡率的全身感染性疾病,探寻有效防治药物及阐明关键药效机制是该领域的研究焦点。以往对内毒素血症的研究主要集中在肺脏和肾脏上,作为机体重要解毒器官,肝脏在内毒素血症中发挥着重要的作用。内毒素血症属于一种炎症,炎症致急性肝损伤(Septic acute liver injury,SALI)的病理生理学机制研究多集中在炎症反应方面,近年来研究的关注点开始向氧化应激损伤及肝细胞凋亡方面转移。右美托咪定(Dexmedetomidine,DEX)是一种小动物临床上常用的麻前镇痛、镇静药,除此之外还具有抗炎抗氧化及抗凋亡的作用。本试验选取48只健康雄性SD大鼠,随机均分为8组,分别为C组、M组、D组、A组、G组、CD组、CA组、CS组。M、D、A、G四组按大鼠体重腹腔注射10 mg/kg浓度为10 mg/mL的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)。在LPS注射前30 min,D、A组按大鼠体重腹腔注射30μg/kg浓度为30μg/mL的DEX,G组按大鼠体重腹腔注射10 mg/kg浓度为10 mg/mL的GSK-3β抑制剂SB216763。在DEX注射前30 min,A组按大鼠体重腹腔注射250μg/kg浓度为250μg/mL的阿替美唑(Atipamezole,ATI),C组不做任何处理,CD组按大鼠体重腹腔注射30μg/kg浓度为30μg/mL的DEX,CA组按大鼠体重腹腔注射250μg/kg浓度为250μg/mL的ATI,CS组按大鼠体重腹腔注射10 mg/kg浓度为10 mg/mL的GSK-3β抑制剂SB216763的溶剂。药物作用4 h后对大鼠进行吸入麻醉,之后心脏采血,取出肝脏备用。通过以下三部分:大鼠肝功能检测及肝脏病理组织学观察、肝组织氧化应激指标检测及血清中相关炎性细胞因子检测、DEX可能的保护机制中相关分子标志物mRNA及蛋白表达量变化等一系列检测。探讨DEX对大鼠SALI的保护作用机制及药效靶位。(1)肝功能指标检测结果表明,各组间相比,C组ALT含量最低,M组ALT含量最高,D组的ALT水平较M组有所下降,差异极显著,A组ALT水平较D组相比几乎无差异,G组ALT较M组有所升高。AST的变化趋势与ALT基本一致,但A组较D组有所上升且差异显著。HE染色后观察肝脏病理组织学切片时发现,C组肝小叶结构清晰,无肝细胞变性或坏死,无炎性细胞浸润,M组和A组肝组织中肝细胞坏死,少量空泡变性,肝窦内少量炎性细胞浸润,肝组织充血,D组和G组都有所改善,CD,CA和CS组基本无明显损伤。(2)氧化应激指标检测结果如下,各组间相比,M和A两组MDA和ROS含量高于其余各组,且差异极显著,其余各组MDA和ROS水平较低,具有统计学意义,SOD和GSH各组间变化趋势与MDA和ROS的趋势完全相反。血清中炎性因子结果显示,C组的TNF-α含量最低,M组极显著上升,D组与M组相比显著下降,A组与D组相比极显著上升,G组与M组相比显著下降。IL-6的整体趋势与TNF-α一致,不同的是D组与M组相比极显著下降。IL-1β及IL-18的趋势及差异显著性与IL-6一致。(3)免疫组织化学定位的切片结果显示Nrf2蛋白确实为入核发挥作用,M组与C组相比蛋白表达量极显著下降,D组与M组相比蛋白表达量极显著上升,A组与D组相比蛋白表达量极显著下降,G组与M组相比蛋白表达量极显著上升。P53与c-caspase-3的免疫组化的切片结果也显示为入核发挥作用并且趋势与Nrf2相反。RT-PCR中Nrf2与P53的变化趋势与免疫组化趋势一致。WB结果显示,LPS对抗氧化和抗凋亡相关蛋白的表达具有抑制作用,DEX和GSK-3β抑制剂SB216763对抗氧化和抗凋亡相关蛋白具有上调作用,ATI可以逆转DEX的保护作用。LPS对促凋亡蛋白具有促进表达作用,DEX和SB216763对促凋亡蛋白具有下调作用,ATI仍然可以逆转DEX的保护作用。综合分析试验数据可知α_2肾上腺素受体(Alpha 2 adrenergic receptor,α_2-AR)在DEX对肝脏氧化应激和细胞凋亡的保护作用中起重要拮抗作用,并且DEX通过调节GSK-3β/MKP-1/Nrf2途径产生抗氧化和抗凋亡的作用。得出结论DEX对SALI具有保护作用且通过α_2-AR调控GSK-3β而发挥作用。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S857.124
【图文】：

血清,均值

结果3 结果3.1 肝功能检测结果ALT、AST、TBIL 是检测肝功能的主要指标（SD 大鼠的正常 ALT 和 AST 范围并无国际标准，ALT 大致在 35-69IU/L，AST 在 64.6-187.49IU/L）。图 3-1 表明，M 组 ALT 含量均值为 78.33IU/L，已超出正常范围，高于 C 组且差异极显著（p<0.01），D 组 ALT 含量均值为 48.67IU/L，已恢复正常范围，低于 M 组且差异极显著（p<0.01），A 组 ALT 含量均值为 46.33IU/L，与 D 组相比差异不显著（p>0.05），G 组 ALT 含量均值为 51.67 IU/L，低于 M 组且差异极显著（p<0.01），CD，CA，CS 组与 C 组相比均无显著性差异（p>0.05）。M 组 AST 含量高于 C 组且差异极显著（p<0.01），D 组 AST 含量低于 M 组且差异极显著（p<0.01），A 组 AST 含量高于 D 组且差异显著（p<0.05），G 组 AST 含量低于 M 组且差异极显著（p<0.01），CD，CA，CS 三组与 C 组相比仍无显著性差异。TBIL 的整体趋势与 AST 一致，M 组与 C 组差异显著（p<0.05），D 组与 M 组差异极显著（p<0.01），A 组与 D 组差异显著（p<0.05），G 组与 M 组差异极显著（p<0.01），CD，CA，CS 三组与 C 组相比依然无显著性差异（p>0.05），但是所有数据均在正常范围内发生改变。

大鼠肝组织,箭头,空泡变性,出血点

东北农业大学农学硕士学位论文3-2 显示，C 组，CD 组，CA 组，CS 组肝组织结构正常，肝小叶结构清晰，肝细胞无变性坏死，无炎性细胞浸润；M 组肝组织发生病理改变，包括黑色箭头所指的肝细胞坏死，白色箭头所指的少量空泡变性，黄色箭头所指的少量炎性细胞浸润，红色剪头所指的肝窦，肝细胞充血。D 组应用 DEX 后显著减少 LPS 诱导的肝细胞坏死，空泡变性和炎性细胞浸润，但仍有如红色剪头所指的出血点。A 组的病理组织学结果与 M 组相似，有黄色箭头所指的少量炎性细胞浸润，红色箭头所指的出血点，白色箭头所指的少量空泡变性，G 组观察结果与 D 组类似，如红色箭头所指仍有少量出血点。每组切片随机选取三个视野按照标准进行肝脏病理组织学评分，出血点 1 分，炎性细胞浸润 1 分，细胞坏死 1 分，空泡变性 1 分[74]。

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