霍乱弧菌MSH基因簇表达调控的分子机制研究

发布时间：2020-06-21 21:31

【摘要】：霍乱弧菌为革兰氏阴性菌,是流行性病霍乱的病原体。霍乱弧菌的侵染周期分为两个阶段:一个阶段处于体外的水生环境,另一个阶段处于宿主体内的肠道环境。霍乱弧菌生物被膜的形成无论是在体外的水生环境还是在体内的肠道环境中对于霍乱弧菌的生存而言都发挥了巨大的作用。而霍乱弧菌的IV型菌毛(MSHA,Mannose-sensitive Hemagglutinin)对于生物被膜的形成至关重要。研究发现当霍乱弧菌进入宿主肠道后MSHA基因簇的表达受到抑制,然而在感染霍乱的病人的粪便中可观察到以生物被膜形式存在的霍乱弧菌。因此,我们推测霍乱弧菌很可能在侵染初期需要抑制MSHA菌毛的表达,以逃逸宿主天然免疫系统的攻击,然而在侵染后期又需要形成新的生物被膜,以便其进入下一个侵染周期。然而,霍乱弧菌中MSHA基因簇的调控机制仍然不清楚。MshH是大肠杆菌调节蛋白CsrD的同源物,是一种特殊而复杂的转录后调控级联的组成部分。在大肠杆菌中CsrD能够增强对调控蛋白CsrA与mRNA的结合具有抑制作用的RNase E的依赖性降解,而在霍乱弧菌中其功能未知。本研究旨在探究mshH基因表达调控的分子机制。首先构建霍乱弧菌基因表达文库,利用荧光报告系统对该基因文库进行筛选,通过对2.5万菌株的筛选,发现在大肠杆菌中VC1371能特异性的激活mshH的转录。为了进一步确定VC1371蛋白是否直接调控mshH基因的表达,利用过镍柱纯化的方法成功纯化得到VC1371蛋白,通过凝胶电泳迁移实验(EMSA,Electrophoretic Mobility Shift Assay),结果发现VC1371可以与mshH的启动子序列结合,经过荧光素酶报告系统检测,发现mshH在霍乱弧菌vc1371基因缺失突变株(?vc1371)中的表达相比较野生型明显减弱。通过分析突变株生物被膜的形成情况,发现当VC1371缺失后,生物被膜的形成减少。这说明在霍乱弧菌中VC1371可以调控mshH的转录,并通过对mshH的调控作用影响霍乱弧菌生物被膜的形成。通过制备MshA多克隆抗体并对霍乱弧菌野生型菌株和?vc1371的MshA蛋白水平进行分析,结果发现MshA在?vc1371中的表达量相比野生型减弱。而在VC1371回补株中MshA表达量得到恢复,甚至比野生型更高。这说明,霍乱弧菌VC1371可能通过激活mshH的表达从而调控MshA的合成。为了验证VC1371对mshH的调控是否在霍乱弧菌宿主定殖过程中发挥作用,将?vc1371和vc0398的基因缺失突变株(?vc0398)分别与野生型菌株进行乳鼠和成鼠的肠道竞争定殖实验,结果表明?vc1371与?vc0398在乳鼠肠道中的定殖能力比野生型菌株要强,而?vc1371与?vc0398在四周龄的成鼠中的定殖能力均比野生型要弱。综上所述,本研究证明了VC1371可以特异性激活霍乱弧菌中mshH的表达,VC1371的缺失会使mshH的启动子表达减弱、MshA蛋白表达降低以及生物被膜的形成减少,并且VC1371蛋白可以在体外与mshH的启动子序列结合。最后发现?vc1371与?vc0398在霍乱弧菌感染的初期和后期的宿主定殖中发挥了一定的作用。本研究结果为研究MSH基因簇的表达调控以及生物膜形成的分子机制方面奠定了一定的基础。
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61
【图文】：

的转化的平板上长出的0 管。每个库再吸取 1 m每个库再按照“1 mL 菌液载体酶切验证法，成功提取了霍乱弧菌值为 1.8~2。将基因组进验证如图 2.1 所示。载体24-Km，泳道 2 为酶切后

载体酶切验证法，成功提取了霍乱弧菌值为 1.8~2。将基因组验证如图 2.1 所示。载体24-Km，泳道 2 为酶切后 2.1 霍乱弧菌基因组酶切ication of Vibrio cholerae gen

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