枯草芽孢杆菌表达产气荚膜梭菌α，β和ε毒素融合蛋白对小鼠的免疫保护作用

发布时间：2020-06-21 23:14

【摘要】：产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)一直被认为是一种危害性较强的人畜共患病病原体,能够引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症以及人畜创伤性气性坏疽,由于其引起的部分疾病兼具发病快、死亡率高的特点,对畜牧养殖业具有极大的潜在威胁性。产气荚膜梭菌发病的主要因素是其分泌的外毒素,而根据细菌产生的主要毒素α(Cpa),β(Cpb),ε(Etx),iota(Cpi),可将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E 5种毒素型,其中α、β和ε是最主要的致病毒素。在当前畜牧养殖业中,接种是最常用的预防措施,而此类疫苗主要由从产气荚膜梭菌培养物中获得的类毒素组成。与常规类毒素相比,重组疫苗具有针对性强、稳定性和安全性高以及商业空间大的特点,已经作为为一种更加具有前景的免疫接种方案而被广泛研究。此外,枯草芽孢杆菌作为一种极具潜力的外源蛋白表达宿主菌,有着人和动物作为益生菌和食品添加剂使用的安全记录,显著的耐热性,其不论是用来高效表达外源蛋白还是作为口服疫苗或全细胞酶的载体,都展现出其他细菌无可比拟的优势,是研究较多、应用广泛的生物安全菌。先前的研究已经证明了Cpa~(247-370)能够赋予针对产气荚膜梭菌α毒素的攻毒免疫力,而具有H106P突变的Etx~(H106P)被认为是用于预防由产气荚膜梭菌引起的动物疾病的最佳特异性疫苗候选物,而β毒素目前尚未有比较明确的研究证明其有效表位,本研究针对这一现状,对β毒素的有效表位进行了预测。对β毒素蛋白二级结构、亲水性、可塑性、抗原性、氨基酸信号肽序列及切割位点进行预测,建立β毒素蛋白的三维空间结构模型。在线服务器以5个连续残基为最低标准预测线性和不连续的抗原表位,标记β毒素蛋白优势抗原表位,筛选、截取并建立新蛋白三维空间结构模型。构建重组质粒pET28a-Cpb~(108-305),经电转化转入大肠杆菌感受态BL21,通过Western免疫印迹分析对表达产物做出鉴定,结果显示在约24kda有明显条带。分3组进行小鼠免疫实验,每组分别口服BL21-pET28a-Cpb~(108-305)菌液(0.2 ml,10 ~(10) CFU/ml)、BL21-Cpb菌液(0.2ml,10 ~(10) CFU/ml)和PBS液(0.2 ml),各组分别在免疫后的第0、7、14、21、28和35 d取3只小鼠从尾静脉采集血液并分离血清,同时收集小鼠肠道灌洗液。采用间接ELISA方法对免疫小鼠的血清和肠道灌洗液样品进行检测,比较新蛋白Cpb~(108-305)与β毒素蛋白之间的免疫效果。结果表明预测筛选的新蛋白Cpb~(108-305)与β毒素蛋白的免疫效果基本相同。基于已知可行的Cpa~(247-370)和Etx~(H106P)表位及预测的β毒素蛋白的有效抗原表位Cpb~(108-305),本研究近一步构建包含α、β和ε三种毒素蛋白保护性表位的融合蛋白,并选用枯草芽孢杆菌构建原核表达系统。分别设计合成三对特异性引物,利用PCR技术从B型产气荚膜梭菌中分别扩增出Cpa~(247-370)、Cpb~(108-305)和Etx基因序列,通过SOE-PCR将第74位氨基酸(组氨酸)突变为甘氨酸,将ε毒素第118位氨基酸(组氨酸)突变为脯氨酸,利用SOE-PCR将已扩增并突变完成的Cpa~(247-370)、Cpb~(108-305)和Etx~(H106P)三段序列重组连接成一段新的融合序列Cpa~(247-370)-Cpb~(108-305)-Etx~(H106P)(Cpa-b-x)。将PCR扩增出来的Cpa-b-x基因片段连接到pHT43表达质粒构建重组表达质粒pHT43-Cpa-b-x,基因测序鉴定准确性。通过电转化方式将重组表达质粒转化到提前制备好的枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞中,从LB平板(添加氯霉素抗性)上筛选出阳性转化子。诱导表达Cpa-b-x融合蛋白,通过SDS-PAGE和Western Blot对表达产物做出鉴定,结果显示在约71.15 kda附近有明显条带,成功表达了Cpa-b-x融合蛋白。为了评价融合蛋白的免疫效果,我们进一步对融合蛋白进行多项免疫检测。随机将175只6周龄SPF小鼠分为5组,分别口服免疫同等剂量枯草芽孢杆菌pHT43-Cpa-b-x(Bs-pHT43-Cpa-b-x)、枯草芽孢杆菌pHT43(Bs-pHT43)、枯草芽孢杆菌(Bs)、Cpa-b-x纯化蛋白和PBS,并于初次免疫后第10-14 d和24-28 d加强免疫。分别于接种以后的第0、7、14、21、28、35、42、49 d采集外周血和肠道灌洗液(每组3只),然后通过ELISA方法分别检测血清抗体及肠道黏膜抗体效价、血清细胞因子(白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ))水平,采用MTT比色法测T淋巴细胞转化率,采用流式细胞技术检测外周血CD4~+与CD8~+水平。第3次加强免疫后1一周,随机从每组选出10只小鼠腹腔注射10×LD_(50)的B型产气荚膜梭菌,连续7d观察已攻毒小鼠的发病及死亡情况并及时记录,一周后进行肠道组织病理检测。结果表明,小鼠口服免疫Bs-pHT43-Cpa-b-x后能够刺激机体产生特异性抗体,免疫保护效果显著优于其他组,此外,枯草芽孢杆菌一定程度增强了机体的免疫应答。本研究通过对β毒素进行预测,成功筛选出与β毒素具有相似免疫效果的保护性表位,基于此构建出能够预防α、β和ε三种毒素的重组融合蛋白Cpa-b-x。研究证明Cpa-b-x蛋白能够有效提升机体的免疫防御,对小鼠具有显著的保护作用,而枯草芽孢杆菌作为益生菌对机体也具有一定程度的免疫调理作用,本研究为产气荚膜梭菌重组体研究更新了理论数据,为产气荚膜梭菌病口服重组疫苗的研究提供了技术依托。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.616
【图文】：

示意图,表达质粒构建,示意图,登录号

图 1 pHT43-Cpa-b-x 表达质粒构建示意图Fig. 1 Schematic diagram of pHT43-Cpa-b-x expression plasmid construction2.3.2 重组产气荚膜梭菌Cpa-b-x基因PCR扩增从NCBI中检索获取羊产气荚膜梭菌β毒素基因序列 Cpa（GeneBank登录号：AY823400.1） Cpb（GeneBank登录号：KP064408.1）和 Etx（GeneBank登录号：JX010451.1）根据枯草芽孢杆菌 pHT43 表达质粒上的酶切位点信息，选取 BamHI和 SmaI 作为本研究的酶切位点，根据酶切位点及 Cpa Cpb 及 Etx 序列信息设计以下引物：表 7 用于获取 Cpb108-305 Cpb108-305和 ETXH106P毒素蛋白序列的引物Table 7 Primer for obtaining Cpb108-305, Cpb108-305and ETXH106Ptoxin protein sequence名称引物序列（5′-3′）F2 GGATCCATGTATGCAGCA

β毒素,蛋白二级结构,可及性

图 2. β 毒素蛋白二级结构预测Fig. 2 Prediction of secondary structure of β-toxin protein3.1.1.2 亲水性、表面可及性和可塑性蛋白亲水性以及表面可及性是决定蛋白三维结构和可接触性的重要因素(于天飞等, 2007) 根据 Kyte-Doolittle 的方案测得的结果如图所示，β 毒素蛋白整体亲水性较高，30~300 区段基本均为亲水性，且 70%左右亲水性较强，只有 N 端以及中间小部分为疏水性区域；Emini 方案预测蛋白表面可及性显示蛋白分子表面可及性高的区域相对较多，主要位于分子外表面，其中 N 端和 C 端表面可及性均较低；采用 Karplus Schulz的方案预测 β 毒素蛋白的可塑性，结果显示可塑性较高区域集中在 30~300 区段，分布较为均匀，以 120~230 区段最佳结合亲水性，表面可及性及可塑性综合分析，30~300区段亲水性强表面可及性高可塑性好，此段满足形成表位的客观条件，形成表位的概率较大

【参考文献】