精源性Bta-miR-301a对牛早期胚胎发育影响的初步研究

发布时间：2020-06-24 20:15

【摘要】：精子是一种遗传物质高度浓缩的细胞,由于其RNA的含量显著低于卵母细胞,使得大多数科研工作者忽略了精子RNA的功能而将与胚胎发育相关的研究聚焦在了卵母细胞RNA。RNA组成性分析表明,精子RNA主要由mRNAs、miRNAs、tRNAs和siRNA组成,这些RNAs能通过受精过程随精子进入卵母细胞,暗示精源性miRNA与endo-siRNA在胚胎发育过程中扮演重要角色。因此,更深入探讨精源性miRNAs的功能对我们扩展早期胚胎发育事件及其调控机理的认识是十分必要的。本研究根据已有文章公布的miRNA测序数据以及本课题组构建的牛精子small RNA文库,初步筛选出bta-miR-301a作为研究对象。随后利用实时荧光定量PCR检测方法证实了bta-miR-301a为精源性miRNA。综合多个数据库预测miR-301a的靶基因,取交集后进行基因聚类分析,选择可信度较高的TGF-β通路的靶基因用于后续研究。通过靶基因mRNA物种保守性比对、3’-UTR结合位点查询、MII期卵母细胞表达水平检测以及双荧光素酶报告基因检测后,最终确定ACVR1为miR-301a的靶基因。荧光定量PCR结果显示,体外受精组原核至2-细胞发育过程中,bta-miR-301a的表达量显著下降,靶基因ACVR1的表达趋势在孤雌组、核移植组及体外受精组胚胎中也存在差异。其中,在MII期卵母细胞至体外受精2-细胞发育阶段,ACVR1的表达量显著降低,而核移植组与孤雌组的表达量却显著升高。因此,暗示精子miR-301a可能靶向下调了体外受精组2-细胞时期ACVR1的表达。为了确定mi R-301a对牛早期胚胎发育的影响,对激活后的卵母细胞进行了mi R-301a mimic的显微注射试验。与对照组相比,注射组孤雌胚胎2-细胞时期的ACVR1蛋白表达量显著降低,第一次卵裂时间延长并且囊胚率升高。因此,推测2-细胞时期,mi R-301a能够靶向调控ACVR1延长了第一次卵裂时间并影响后续囊胚的发育。综上所述,本研究初步确定了精源性miR-301a能够影响牛早期胚胎发育进程。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S823
【图文】：

卵母细胞,2-细胞胚胎,体外受精,组间

分析各个靶基因的 CT 值，根据 CT 值的大中的表达情况。1a 精源性验证量 PCR 的检测方法，分别测定了 MII 期卵母细胞、IV、SCNT 类原核期胚胎及 SCNT 2-细胞胚胎中 bta-miR-以 MII 期卵母细胞作为参照样本，按照 2- Ct的计算方趋势，并用 t 检验进行差异性分析。结果如图 3-1 所胚胎的相对表达量显著高于 MII 期卵母细胞及 2-细胞在 SCNT 胚胎中，miR-301a 在类原核期的相对表达量显)，但却显著高于 SCNT 2-细胞胚胎(P＜0.05)。urve Analysis1min Increment rate 0.5℃/s

核移植,靶基因,卵母细胞,组间

a 在 MII 期卵母细胞、核移植类原核期胚胎及核移植 2-细胞胚同组间的显著性差异(P＜0.05)。bundance of bta-miR-301a in MII oocytes; embryos of Pseudo-Prcell stage in SCNT. Different letters indicate differences (P <1a 靶基因预测及通路分析、TargetScan 与 PicTar 数据库中 miR-301a 靶基因预测据库中共有 361 个交集的靶基因。

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