表达ASFV保护性抗原重组腺病毒载体疫苗的初步研制

发布时间：2020-06-30 01:58

【摘要】：非洲猪瘟 ASF(African swine fever),是由非洲猪瘟病毒 ASFV(African swine fever virus)引起的家猪及野猪高死亡率的一种疾病。ASFV是大型双链DNA病毒,长约180 kb,编码蛋白多达180个。ASFV主要通过接触传播,短距离内也可通过空气传播,感染猪肺泡巨噬细胞引起家猪及野猪急性高热症状。目前,ASFV现已传播至中国大部分省市,造成了巨大的经济损失。迄今为止,尚无有效的ASFV疫苗,重组腺病毒载体疫苗能够诱导坚强的细胞免疫及体液免疫应答,且安全性更高。因此,本研究旨在制备表达多种ASFV保护性抗原的重组腺病毒载体,为研究ASF重组腺病毒载体疫苗提供借鉴。EP153R(EP153R)、CD2v(EP402R)、p54(E183L)和 p72(B646L)蛋白在 ASFV 复制、包装等过程中均具有重要作用,是ASFV重要的保护性抗原。以EGFP为标签蛋白,构建pShuttle-EGFP-EP 1 53R-EP402R、pShuttle-EGFP-EP153R-E183L 和 pShuttle-EGFP-B646L;为提高免疫效果,以CTLA4部分序列为先导序列,构建pShuttle-CTLA4-EP 153R-EP402R、pShuttle-CTLA4-EP153R-E183L 和 pShuttle-CTLA4-B646L,构建完成的载体分别转染 293T 细胞,western blot对融合蛋白表达进行验证(pShuttle-CTLA4-B646L不表达),正确表达的质粒转化到BJ5183大肠杆菌重组菌株中,分别重组为pAd-EGFP/CTLA4-EP 153R-EP402R、pAd-EGFP/CTLA4-EP153R-E183L 和 pAd-EGFP-B646L 重组腺病毒载体,转染 293A 细胞包装重组腺病毒,重组腺病毒皮下注射小鼠进行免疫,一免后7天进行加强免疫,分别于一免后14d、30d、46d采血收集血清,使用原核表达产物EP153R蛋白及EGFP蛋白检测血清中特异性抗体产生水平;一免后50d采集脾脏及腋下、腹股沟淋巴结,使用原核表达蛋白EP153R与EGFP蛋白刺激淋巴细胞,分别检测脾脏及淋巴结细胞增殖水平;同时使用流式细胞仪检测抗原刺激后CD3+细胞中IFN-γ+细胞比例,分析重组腺病毒免疫后小鼠对同种抗原的识别及反应程度。结果表明:成功构建的5种融合表达ASFV保护性抗原的重组腺病毒免疫小鼠后,均能诱导小鼠产生特异性抗体,且CTLA4为佐剂的重组腺病毒免疫组能引起更好的体液免疫,EP153-CD2v 比EP153R-p54蛋白引起的体液免疫更强,EGFP-p72蛋白引起的体液免疫反应较弱;淋巴细胞增殖实验显示,Ad-EGFP-p72免疫组淋巴细胞经EGFP蛋白刺激后可增殖分化,其余免疫组经EP153R刺激后无明显增殖。流式结果与淋巴细胞增殖实验相符,EGFP蛋白刺激Ad-EGFP-p72免疫组有特异性IFN-y分泌,其余组经EP153R蛋白刺激后无明显变化。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.651
【图文】：

性、高接触性传染病，即非洲猪瘟。非洲猪瘟临床症状官出血、高死亡率为主要特征，目前无有效的疫苗用于对养猪业造成巨大损失。该病属于世界动物卫生组织（Ｏ我国动物病原微生物名录中将其列为一类动物疫病。逡逑学逡逑结构逡逑型的细胞内复制的病毒，病毒粒子呈二十面体对称，平均核质体、核衣壳、囊膜（分为外层与内层）：核质体主（ｐｌＯ、Ｐ１４、ｐ３７、ｐ３４及ｐｌ５０等）及基因早期转录所需白ｐ７２和ｐｌ７，由大约２０００个壳粒组成；内侧囊膜来源、ｐ３２、ｐ５４、及ＣＤ２ｖ蛋白，外层囊膜为病毒出芽附带榦~=“二．灄譬逡逑

细胞铺板及接毒过程如上所示，接毒５邋ｄ后弃去培养基，加入２００邋＾１４％多聚甲醛固定逡逑１５ｍｉｎ，弃去固定液，加入ＰＢＳＴ清洗２次，力口入－８０°Ｃ预冷的无水乙醇加固ｌＯｍｉｎ，邋ＰＢＳＴ逡逑清洗４次，加入５％邋ＢＳＡ封闭液室温封闭２邋ｈ，ＰＢＳＴ清洗３次，加入１００邋＾丨按照丨：８00稀逡逑释的ＨＡ—抗，４°Ｃ摇床孵育过夜，ＰＢＳＴ清洗５次，加入１００邋４邋１：２０００稀释的荧光二抗，逡逑室温孵育ｌｈ，邋ＰＢＳＴ清洗５次，荧光显微镜观察荧光。逡逑１．３结果逡逑１．３．１目的片段ＰＣＲ扩增逡逑分别在邋ＥＧＦＰ、ＥＰ１５３Ｒ、Ｅ１８３Ｌ、Ｂ６４６Ｌ、ＥＰ４０２Ｒ、ＣＴＬＡ４邋两端通过邋ＰＣＲ邋增加修饰逡逑片段，便于载体构建，ＰＣＲ修饰后大小分别为７７０邋ｂｐ、５２２邋ｂｐ、４１１邋ｂｐ、１９７２邋ｂｐ、１１３２邋ｂｐ、逡逑３９５邋ｂｐ，图丨－１邋到图邋１－６邋分别为邋ＥＧＦＰ、ＥＰ１５３Ｒ、Ｅ１８３Ｌ、Ｂ６４６Ｌ、ＥＰ４０２Ｒ、ＣＴＬＡ４邋片段，逡逑１％琼脂糖凝胶电泳结果显示６个片段条带单一且大小均符合预期。逡逑

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本文编号：2734686