牛乳头瘤病毒13型海南株的全基因组克隆及E5蛋白的真核表达

发布时间：2020-07-01 01:06

【摘要】：牛乳头状瘤(Bovine papillomatosis, BP)是由牛乳头瘤病毒(Bovine papilloma-virus, BPV)引起肿瘤发生的慢性增生性疾病。本病无明显的季节性和地区性,为奶牛最常见的肿瘤疾病,多发于体表、粘膜及某些器官。牛乳头状瘤易复发,进而发展为癌症,导致动物死亡,最终造成肉类、奶业和皮革类行业严重的经济损失,而目前尚无有效疫苗来预防牛乳头瘤病的发生。E5蛋白是BPV的主要肿瘤蛋白,通过干扰细胞生长抑制和细胞周期调控来发挥作用,与生长因子受体相互作用,激活细胞增殖。BPV E5蛋白参与细胞转化,且在病毒感染初始以及整个过程中都有表达,改变正常细胞对生长因子的应答,阻碍细胞表面主要组织相容性复合物的表达。鉴于这种种作用,E5具有被用来研发DNA疫苗的重大意义。因此,对于BPV相关功能蛋白的研究可为今后BPV疫苗的开发奠定基础。另外,随着人类性病中尖锐湿疣发病率的急速上升和宫颈癌、肛门癌等疾病的增多,HPV感染越来越引起人们的关注。BPV可以作为研究HPV感染,HPV与宿主以及与环境因素之间的相互作用关系的体内模型,能够为人乳头瘤病的检测与治疗提供理论依据。本实验克隆了牛乳头瘤病毒13型海南株的全基因组,并构建pEGFP-N1-E5重组真核表达载体,在HEK293细胞中表达。利用荧光观察、FCM (Flow Cytometry Method)检测和Western blot鉴定来验证重组蛋白的表达,为牛乳头瘤病的预防性和治疗性疫苗的研发奠定了前期基础。以下为本实验的研究方法和主要结果：1.牛乳头瘤病毒基因分型与全基因组的克隆本研究以来自海口某农场黄牛的牛乳头瘤病料组织为材料,提取病毒DNA。根据乳头瘤病毒衣壳蛋白L1基因的保守序列设计的简并引物FAP59/FAP64进行PCR检测,经过测序和序列比对对该BPV进行了基因分型。结果显示,患病黄牛所感染的BPV类型为BPV-13,命名为BPV-13-HN。设计BPV-13-HN基因型特异性引物,通过扩增、测序、拼接、对比后获得BPV13-HN全基因组序列。实验病毒株基因组全长7961bp,包括8个开放阅读框(open reading frame, ORF),分别为早期基因区E1、E2、E4、E5、E6、E7和晚期基因区L1、L2。 2. BPV-13-HNE5蛋白在HEK293细胞中的表达用PCR扩增E5基因,以pEGFP-Nl为真核表达载体构建重组表达质粒,转染进入HEK293细胞。进行荧光显微观察,流式细胞仪检测和Western Blot鉴定。结果表明：本实验成功构建了重组真核表达质粒,可成功表达E5蛋白,为下一步稳定表达E5的细胞系的构建做好初步准备,为E5蛋白的研究及相关疫苗的开发奠定基础。
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65

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