H3N8亚型马流感病毒样颗粒的构建及马Tetherin多样性的研究

发布时间：2017-03-29 05:02

  本文关键词：H3N8亚型马流感病毒样颗粒的构建及马Tetherin多样性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：马流感(Equine influenza,EI)是由马流感病毒(Equine Influenza Virus,EIV)引起的,以感染马、驴等马属动物为主的急性、高度接触性呼吸道传染病。近年来,马术赛事等相关行业蓬勃发展以及养马业逐渐兴起,EI的公共安全问题在国际和国内都得到广泛关注。Tetherin蛋白被认为是对于包膜逆转录病毒具有广泛限制作用的机体天然免疫蛋白。EIV是逆转录病毒的一种,已经证实Tetherin能限制其出芽。但是Tetherin蛋白在不同物种,甚至同一物种的不同个体中,都存在着基因水平的多样性,序列差异从0.5%到4%不等,而序列上的差异可能会直接影响Tetherin对病毒的限制作用。本实验通过采集马匹血样,抽提RNA、反转录DNA,连接到pLB载体送公司测序,然后从中保留存在突变序列,将突变序列连接到载体pCMV-10上,构建了Tetherin突变序列的真核表达载体。从18匹马匹中,共获得了124个Tetherin序列,其中存在突变序列26个,突变类型包括替换、缺失以及提前终止,其中,两个提前终止突变以及21号氨基酸位点突变极具参考价值。这些突变序列真核表达载体的成功构建,对于实验室后续研究Tetherin各个位点的功能以及Tetherin多样性与功能的联系等方向提供了参考和支持。病毒样颗粒(Vriurs-likeParticles,VLPs)是近年来研究热点,在新疫苗开发、分子载体以及研究某些特定蛋白的作用和病毒感染细胞机制等基础研究方面具有广泛应用。使用哺乳动物细胞表达系统构建马流感VLPs在之前的研究中未有报道,且哺乳动物细胞表达系统可以最高程度的修饰VLPs,使VLPs具有和天然病毒颗粒更相似的天然构象,特别是在基础研究方面,该表达系统构建的VLPs具有更强的模拟性和过程重现性。本实验选取马流感H3N8(A/equine/Miami/1/63)的HA、NA、M1、M2这4个主要结构蛋白,构建真核表达载体,共转染293T细胞收集细胞上清液中的VLPs。对上清液测血凝,血凝效价为23。而后用自制的马流感兔源抗体对经过超离纯化的VLPs进行Western-blot鉴定,得到明显对应的病毒HA条带。多角度证明使用哺乳动物细胞表达系统成功构建了马流感VLPs。构建成功的马流感VLPs可以用于实验室后续的EIV研究,在基础研究方向,如病毒出芽机制等研究上具有很大帮助。
【关键词】：马流感 病毒样颗粒 Tetherin 多样性
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-11
• 1 前言11-21
• 1.1 流感病毒概述11
• 1.2 马流感11-14
• 1.2.1 马流感概述11-12
• 1.2.2 结构蛋白及其作用12-13
• 1.2.3 流行病学13-14
• 1.3 Tetherin14-16
• 1.3.1 Tetherin蛋白的概述14
• 1.3.2 Tetherin多样性14-15
• 1.3.3 本研究的目的和意义15-16
• 1.4 病毒样颗粒16-21
• 1.4.1 病毒样颗粒简介16-18
• 1.4.2 病毒样颗粒常用构建方法18-19
• 1.4.4 本研究的目的和意义19-21
• 第一部分 马源Tetherin多样性研究21-40
• 1 材料和方法21-31
• 1.1 材料21-23
• 1.1.1 样品来源21
• 1.1.2 主要试剂21
• 1.1.3 主要溶液配制21-22
• 1.1.4 主要仪器及设备22-23
• 1.1.5 分子生物学软件23
• 1.2 方法23-31
• 1.2.1 引物的设计与合成23
• 1.2.2 血液RNA的提取23-24
• 1.2.3 目的基因cDNA第一链合成24
• 1.2.4 目的基因的PCR扩增24-25
• 1.2.5 PCR产物的回收与纯化25-26
• 1.2.6 回收纯化DNA的连接26
• 1.2.7 转化26-27
• 1.2.8 重组真核表达质粒的构建及鉴定27-28
• 1.2.9 回收产物的连接28
• 1.2.10 连接产物转化感受态细胞及重组质粒的菌液PCR鉴定28-29
• 1.2.11 重组质粒的酶切鉴定29
• 1.2.12 重组表达质粒的抽提29-31
• 2 结果31-36
• 2.1 目的基因Tetherin的PCR扩增结果31
• 2.2 含有目的片段的pLB载体菌液PCR检测结果31-32
• 2.3 重组质粒的菌液PCR检测结果32-33
• 2.4 重组质粒的酶切鉴定33-34
• 2.5 Tetherin序列分析结果34-36
• 3 讨论36-39
• 4 结论39-40
• 第二部分 马流感病毒样颗粒的构建40-57
• 1 材料和方法40-49
• 1.1 材料40-41
• 1.1.1 毒株、质粒、细胞与实验动物40
• 1.1.2 主要试剂40
• 1.1.3 主要溶液配制40-41
• 1.2 方法41-49
• 1.2.1 PCR引物设计与合成41-42
• 1.2.2 HA、NA、M1、M2基因的扩增42-43
• 1.2.3 目的片段及载体酶切处理43-44
• 1.2.4 载体与目的片段的连接44
• 1.2.5 转化以及重组质粒的菌液PCR鉴定44
• 1.2.6 重组质粒的酶切鉴定44
• 1.2.7 重组质粒的制备44
• 1.2.8 哺乳动物细胞复苏、传代、冻存44-45
• 1.2.9 H3N8 EIV真核表达质粒的转染45
• 1.2.10 马流感H3N8兔源抗体的制备45-47
• 1.2.11 马流感H3N8兔源抗体的Western-blot鉴定47
• 1.2.12 使用哺乳动物表达系统制备H3N8 EIV病毒样颗粒47-48
• 1.2.13 马流感VLPs的血凝活性测定48
• 1.2.14 VLPs的超速离心纯化48
• 1.2.15 Western-blot检测VLPs的表达48-49
• 2 结果49-54
• 2.1 HA、NA、M1、M2基因的PCR扩增结果49
• 2.2 重组质粒的双酶切鉴定结果49-50
• 2.3 自制兔源马流感抗体Western-blot鉴定50-51
• 2.4 马流感VLPs的血凝效价结果51-52
• 2.5 马流感VLPs超速离心纯化52
• 2.6 马流感VLPs的Western-blot鉴定52-54
• 3 讨论54-56
• 4 结论56-57
• 致谢57-58
• 参考文献58-61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 尹鑫;魏萍;王晓钧;;天然免疫限制因子Tetherin的抗病毒机理研究进展[J];生物化学与生物物理进展;2014年01期

2 龙遗芳;郭中敏;陆家海;;病毒样颗粒技术——现代生物医学应用的新平台[J];中国病毒病杂志;2013年04期

3 吴蒙;张定梅;陆家海;;流感病毒样颗粒疫苗研究进展[J];中山大学学报(医学科学版);2009年05期

4 郭建强;张智清;;病毒样颗粒技术的研究进展[J];中国疫苗和免疫;2009年02期

5 孙高超;毕可东;张娜;丁超;邹本革;庞天津;;马流感简介[J];动物医学进展;2008年08期

6 赵文成;许娇娜;;我国马流感的研究现状[J];畜牧兽医科技信息;2008年06期

7 闫若潜,杜向党;流感病毒基因组结构及其编码蛋白研究进展[J];动物医学进展;2004年01期

8 殷震;我国21世纪动物疫病防制的形势与策略[J];中国禽业导刊;1999年23期

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本文编号：273703