复方陈皮粉对猪胃肠道菌群多样性的影响

发布时间：2017-03-29 05:13

  本文关键词：复方陈皮粉对猪胃肠道菌群多样性的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本研究以饲喂复方陈皮粉的试验组和未饲喂复方陈皮粉的对照组的猪粪便样品作为研究对象,通过宏基因组学方法和宏蛋白质组学方法研究两组试验猪胃肠道中微生物的多样性,并通过比较两组微生物多样性分析复方陈皮粉对猪胃肠道微生物的影响,从而进一步分析复方陈皮粉药效的作用机制。将60头试验猪随机分为2个组,每组3个重复,每个重复10头猪；对照组和试验组分别饲喂基础日粮和添加0.2%复方陈皮粉的基础日粮,共计60 d；饲喂过程定期采集新鲜粪便,采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)和末端限制性内切酶片段长度多态性(T-RFLP)指纹图谱技术研究两组试验猪胃肠道菌群多样性；结合双向电泳和质谱鉴定方法分析差异蛋白质,并于NCBI蛋白质数据库比对差异蛋白质种类,进一步研究胃肠道菌群结构；再结合内毒素检测技术分析胃肠道内毒素含量,分析复方陈皮粉对胃肠道革兰氏阴性菌及其释放的内毒素的影响。结果表明,试验期间试验组的猪基本不出现腹泻,对照组有部分猪经常出现腹泻现象。DGGE图谱显示,猪胃肠道菌群物种丰富,两组样品之间存在明显的条带差异。选取11条DGGE共性条带和特异条带进行克隆测序,用BLAST工具与GenBank数据库中已有序列进行比对,其中两组的共性条带对应的数据库中最相近菌种为大肠杆菌、厚壁菌门中的不可培养的一个菌种、杆菌门中的不可培养的一个新种和链球菌属的新种。对照组特有条带对应的数据库中最相近菌种为密螺旋体属的新种、变形菌门中的不可培养的一个新种和产气荚膜梭菌属的新种。试验组特有条带对应的数据库中最相近菌种为鼠李糖乳杆菌、柔嫩梭菌属的新种、类肠膜明串珠菌属的新种和嗜酸乳杆菌属的新种。T-RFLP指纹图谱技术检测结果通过RDP数据库查询比对,在两组粪便样品中,相同的T-RFs片段有27个,包括14个属,分别为类芽孢杆菌属、密螺旋体属、微小杆菌属、梭菌属、乳杆菌属、螺杆菌属、优杆菌属、噬纤维菌属、组织菌属、丁酸弧菌属、魏斯氏菌属、片球菌属、链球菌属和硝化螺旋菌属。其中大部分是机会致病菌和动物胃肠道中的正常菌群成员,仅有少部分为致病菌。对照组的特有片段中对应的细菌种类为有益菌、致病菌和机会致病菌,其中大部分为有害菌和机会致病菌。试验组特有的片段对应的细菌种类虽然也有有益菌、致病菌和机会致病菌,但致病菌和机会致病菌的数量明显少于对照组,有益菌占多数。通过比较蛋白组学在两组样品中获得的多个差异蛋白点,选择其中7个相对清晰的差异蛋白点通过数据库对比得出其对应的细菌种属为肠炎沙门氏菌、密螺旋体、鼠李糖乳杆菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽孢杆菌、小牛葡萄球菌、猪丹毒丝菌。所取的差异蛋白点1个来自试验组中较清晰的蛋白点为鼠李糖乳杆菌,6个来自对照组中较清晰的蛋白点,这六种被鉴定的蛋白质均为致病菌或机会致病菌。对照组与试验组在饲喂复方陈皮粉初期胃肠道的游离内毒素浓度相差不大,但是在中后期两组的内毒素浓度出现了比较大的差异。对照组的内毒素浓度总体呈上升趋势,而试验组虽有略微差异,但幅度不大,呈平稳趋势。第20 d以后,试验组与对照组之间内毒素浓度差异显著(P0.05)。综合本实验的各项研究结果,可以看出复方陈皮粉具有减轻或有效预防猪腹泻等胃肠道疾病。复方陈皮粉的药效作用改善了肠道微环境,维持或建立了新的动物肠道菌群平衡,使猪胃肠道菌群趋于更健康状态。因此可认为复方陈皮粉的药效作用可能是与改变、调节体内的微生态系统以达到新的微生态平衡有关。
【关键词】：复方陈皮粉 DGGE技术 T-RFLP指纹图谱技术 比较蛋白组学 肠道菌群平衡
【学位授予单位】：福建农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828.5
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 1 引言12-26
• 1.1 复方陈皮粉的研究进展12-14
• 1.1.1 陈皮12-13
• 1.1.2 石榴13
• 1.1.3 黄柏13-14
• 1.1.4 白头翁14
• 1.2 动物胃肠道菌群研究进展14-17
• 1.2.1 动物胃肠道微生物正常菌群14-15
• 1.2.2 动物胃肠道微生物菌群的作用15-17
• 1.3 动物胃肠道菌群的分析方法研究进展17-25
• 1.3.1 基于宏基因组学方法17-21
• 1.3.2 基于宏蛋白质组学方法21-23
• 1.3.3 基于细菌内毒素的研究方法23-25
• 1.4 本项目研究目的和意义25-26
• 2 材料与方法26-40
• 2.1 材料26-28
• 2.1.1 药材26
• 2.1.2 仪器26-27
• 2.1.3 试剂27
• 2.1.4 溶液的配制27-28
• 2.2 试验方法28-40
• 2.2.1 试验设计28-29
• 2.2.2 样品采集29
• 2.2.3 肠道总DNA的提取29-30
• 2.2.4 DGGE分析方法的建立30-33
• 2.2.5 T-RFLP分析方法的建立33-35
• 2.2.6 蛋白质提取35-36
• 2.2.7 蛋白质组学研究方法的建立36-39
• 2.2.8 内毒素含量检测39-40
• 2.2.9 数据处理40
• 3 结果与分析40-55
• 3.1 复方陈皮粉对猪生长性能的影响40-41
• 3.2 细菌总DNA提取质量41
• 3.3 细菌总DNA的16S rDNA V3区PCR检测结果41-42
• 3.4 细菌总DNA的16S rDNA全长的PCR检测结果42
• 3.5 DGGE指纹图谱42-44
• 3.6 DGGE图谱主要条带的克隆测序44-46
• 3.7 Msp Ⅰ和HaeⅢ的T-RFLP图谱46-47
• 3.8 细菌多样性指数47
• 3.9 T-RFs片段比对结果47-51
• 3.10 蛋白质浓度检测结果51
• 3.11 SDS-PAGE电泳结果51-52
• 3.12 2-DE电泳结果52-53
• 3.13 质谱检测结果53
• 3.14 内毒素浓度检测结果53-55
• 4 讨论55-63
• 4.1 试验方法的讨论55-59
• 4.1.1 粪便细菌DNA提取方法55-56
• 4.1.2 PCR-DGGE电泳方法56-57
• 4.1.3 T-RFLP方法57-58
• 4.1.4 蛋白质样品制备方法58
• 4.1.5 双向电泳方法58
• 4.1.6 内毒素检测方法58-59
• 4.1.7 实验设计方法59
• 4.2 试验结果讨论59-63
• 4.2.1 动物胃肠道菌群多样性分析59-61
• 4.2.2 动物胃肠道中蛋白质种类分析61
• 4.2.3 粪便中细菌内毒素含量分析61-62
• 4.2.4 复方陈皮粉药效分析62-63
• 5 结论63-65
• 参考文献65-73
• 致谢73

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本文编号：273747