犬源伪狂犬病毒的分离鉴定及其血清学调查

发布时间：2017-03-29 06:05

  本文关键词：犬源伪狂犬病毒的分离鉴定及其血清学调查，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本试验从江西省南昌市2所宠物医院收集到疑似伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染的病犬2例,经剖检和病理学分析后对其进行PCR检测,并利用体外和体内试验对其中1毒株进行分离鉴定,同时研究两毒株毒力基因gD和gE的分子特征和进化关系。此外,本试验还对南昌市区域内的犬只进行伪狂犬(Pseudorabies,PR)的血清学调查。结果如下:1成功从2例犬大脑组织中扩增出大小为346 bp的PRVg E部分基因,并将两毒株分别命名为PRV JX-1-2014株和JX-2-2015株。感染的PK-15细胞在电镜下可观察到实心和中空两种特征的PRV粒子。利用PK-15细胞测得该毒株的TCID50为10-4/0.1mL。利用JX-1-2014株接种成年家兔后呈现典型的PR症状;2成功扩增出大小分别为1208 bp和1770 bp的PRVgD和gE基因。将两江西株与国内外PRV毒株进行比对得知:两毒株均出现了一定程度的变异,其与国外株的亲缘关系较远,而与国内株的亲缘关系较近,其中与国内2011年之后出现的毒株更为亲近;3血清学调查结果显示,调查的犬只有PRV抗体和PRVgE抗体阳性存在,其中PRV抗体总阳性率36.8%(74/201)。结论:病犬确为PRV感染且所分离毒株存在一定程度的变异,目前南昌市辖区存在犬PRV流行的风险。
【关键词】：犬 伪狂犬 病毒 基因 血清学调查
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-8
• 缩略词表8-9
• 前言9-10
• 第一章 伪狂犬病毒分子生物学研究进展10-16
• 1 犬伪狂犬病10-13
• 1.1 流行病学10
• 1.2 犬伪狂犬病的临床症状10-11
• 1.3 犬伪狂犬病的病理学11
• 1.4 犬伪狂犬病的诊断11-13
• 1.4.1 一般检查11
• 1.4.2 血液学检查11-12
• 1.4.3 病毒的分离鉴定12
• 1.4.4 动物接种试验12
• 1.4.5 PCR、荧光定量PCR和LAMP12
• 1.4.6 血清学试验12-13
• 2 伪狂犬病毒的分子生物学特性13-15
• 2.1 病原13-14
• 2.1.1 病毒分类地位13
• 2.1.2 病毒粒子结构13
• 2.1.3 病毒理化特性13-14
• 2.2 PRV分子生物学研究14-15
• 2.2.1 PRV基因组14
• 2.2.2 PRV糖蛋白的结构和功能14-15
• 3 本研究的目的与意义15-16
• 第二章 病例报告16-21
• 1 病例一16-17
• 2 病例二17-20
• 3 病例总结20-21
• 第三章 犬源伪狂犬病毒江西株的分离与鉴定21-32
• 1 材料与方法21-25
• 1.1 待检病料21
• 1.2 细胞株21
• 1.3 主要生化试剂21-22
• 1.4 主要仪器设备22
• 1.5 常用试剂的配制22-23
• 1.6 引物设计与合成23
• 1.7 犬脑组织DNA的提取23
• 1.8 PCR鉴定23
• 1.9 病毒分离23-24
• 1.10 动物接种试验24
• 1.11 细胞培养24
• 1.11.1 细胞复苏24
• 1.11.2 细胞冻存24
• 1.12 病毒感染细胞24
• 1.13 PRV TCID_(50)的测定24
• 1.14 病毒的鉴定24-25
• 1.14.1 细胞CPE24-25
• 1.14.2 培养细胞的PCR鉴定25
• 1.14.3 感染细胞超薄切片的制作25
• 2 结果与分析25-29
• 2.1 病毒PCR鉴定结果25-26
• 2.2 动物接种试验26-27
• 2.3 病毒的分离及鉴定27-29
• 2.3.1 细胞CPE27
• 2.3.2 培养细胞的PCR鉴定27-28
• 2.3.3 感染细胞的电镜观察28-29
• 2.4 病毒TCID_(50)的测定29
• 3 讨论29-31
• 4 小结31-32
• 第四章 犬源伪狂犬病毒江西株g D、g E基因的克隆与测序分析32-49
• 1 材料与方法32-35
• 1.1 主要生化试剂32
• 1.2 主要仪器设备32
• 1.3 常用试剂的配制32-33
• 1.4 引物设计33
• 1.5 PRV DNA模板的制备33
• 1.6 毒力基因的PCR扩增33
• 1.7 目的片段的克隆33-34
• 1.7.1 PCR产物的回收33-34
• 1.7.2 目的片段与克隆载体的连接34
• 1.8 连接产物转化34-35
• 1.8.1 重组质粒的转化34
• 1.8.2 阳性菌落的筛选、鉴定34
• 1.8.3 重组质粒的提取34-35
• 1.8.4 目的片段测序和序列分析35
• 2 结果与分析35-46
• 2.1 PRV江西株g D基因的PCR扩增35
• 2.2 PRV江西株g E基因的PCR扩增35
• 2.3 PRV江西株g D基因分析35-40
• 2.3.1 PRV江西株g D基因核苷酸及编码的氨基酸序列分析35-39
• 2.3.2 PRVg D基因遗传进化分析39-40
• 2.4 PRV江西株g E基因分析40-46
• 2.4.1 PRV江西株g E基因核苷酸及编码的氨基酸序列分析40-44
• 2.4.2 PRVg E基因遗传进化分析44-46
• 3 讨论46-48
• 4 小结48-49
• 第五章 犬源伪狂犬病毒的血清学调查49-53
• 1 材料与方法49-50
• 1.1 血清样品49
• 1.2 主要生化试剂49-50
• 1.3 主要仪器50
• 1.4 ELISA检测50
• 2 结果与分析50
• 3 讨论50-52
• 4 小结52-53
• 全文总结53-54
• 参考文献54-58
• 附录58-62
• 致谢62-63
• 攻读硕士学位期间发表的论文63

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