柔嫩艾美耳球虫耐药相关基因的分析鉴定

发布时间：2020-07-02 20:01

【摘要】：球虫耐药性发展的普遍性及严重性已成为当前球虫病防治中的主要障碍,各国学者对球虫耐药性产生的原因及机制都进行了研究,但球虫耐药性形成的机制至今不明,也没有找到控制球虫产生耐药性的靶基因,还无法解释鸡球虫耐药性产生的分子机制。为了深入研究球虫耐药性产生的分子机制,实验室前期在药物选择压力下诱导获得了柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素耐药株和地克珠利耐药株,利用RNA-sequence分析了这两个耐药株和敏感株的转录组,获得了两个耐药株与敏感株的差异表达基因。本研究在此基础上选择了3个差异表达基因进行特性研究,包括2个耐药株上调表达基因:NADP特异性谷氨酸脱氢酶(NADP-specific glutamate dehydrogenase,NADP-GDH)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD),1个耐药株下调表达基因:表面抗原10(Surface antigen 10,SAG10)。1、3个基因的克隆及生物信息学分析以柔嫩艾美耳球虫敏感株cDNA第一链为模板,成功克隆了柔嫩艾美耳球虫表面抗原10(Et SAG10)基因,柔嫩艾美耳球虫NADP特异性谷氨酸脱氢酶(EtNADP-GDH)基因和柔嫩艾美耳球虫超氧化物歧化酶(EtSOD)基因。利用生物信息学技术对三个基因进行分析,结果显示:Et SAG10基因开放阅读框序列长786 bp,编码261个氨基酸,预测分子质量为27.9 kDa,等电点为4.7;信号肽和跨膜结构分析表明该基因编码的蛋白具有信号肽和跨膜结构,并含有多个功能位点,属于表面抗原(SAG)家族。EtNADP-GDH基因开放阅读框序列长1407 bp,编码468个氨基酸,预测分子质量为51.0 kDa,等电点为6.93;信号肽和跨膜结构分析表明该基因编码的蛋白无信号肽和跨膜结构,含有包括NAD结合位点在内的多种功能位点。Et SOD基因开放阅读框序列长651 bp,编码216个氨基酸,预测分子质量为24.9 kDa,等电点为7.15;信号肽和跨膜结构分析表明该基因编码的蛋白无信号肽,无跨膜结构,但包括多种功能位点。2、3个基因的原核表达及特性初步分析将三个克隆的基因分别连接到原核表达载体,构建了重组表达质粒pGEX-4T-EtSAG10、pColdI-EtNADP-GDH、pET-28a-EtSOD,转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中,成功诱导表达,获得了相应的重组蛋白GSTEtSAG10(rEtSAG10)、His-EtNADP-GDH(rEtNADP-GDH)和His-EtSOD(rEt SOD),且3个重组蛋白均为可溶性蛋白。利用重组蛋白分别免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠,制备了相应的多克隆抗体。免疫荧光定位和入侵抑制实验分析了3个蛋白在虫体中的分布以及是否参与虫体入侵宿主细胞。定位分析发现EtSAG10主要分布在虫体的表面和纳虫空泡膜(PVM)上,随着虫体在DF-1细胞中的发育,EtSAG10表达量增加。EtNADP-GDH主要分布在虫体的表面和细胞质中,随着虫体在DF-1细胞中的发育,荧光变弱,EtNADP-GDH表达量出现下降,但发育为成熟裂殖体后表达量又发生了明显的提升。EtSOD主要分布在子孢子入侵宿主细胞后虫体的顶端和表面,随着细胞内虫体的发育,EtSOD主要定位于未成熟裂殖体和成熟裂殖体的整个表面。入侵抑制实验分析发现EtSAG10和EtNADP-GDH均与子孢子入侵宿主细胞有关,抗体入侵抑制率分别达到60%和45%,而EtSOD对入侵作用不大。球虫4个发育阶段的转录水平分析显示EtSAG10在孢子化卵囊阶段转录水平最高;EtNADP-GDH在未孢子化卵囊阶段转录水平最高;相比之下,EtSOD在第二代裂殖子阶段转录水平最高。3、3个基因在柔嫩艾美耳球虫敏感株与耐药株之间的差异分析收集柔嫩艾美耳球虫敏感株与地克珠利耐药株、马杜拉霉素耐药株的虫体,对三个基因进行转录水平和翻译水平的分析,结果显示:EtSAG10在耐药株中的转录水平和翻译水平均表现为明显的下调。对不同浓度的地克珠利作用下诱导产生的柔嫩艾美耳球虫耐药株检测发现,其翻译水平出现了不规则变化,随着药物浓度升高表现为先上升后下降。且在马杜拉霉素不同浓度的作用下,其翻译水平也出现先上升后下降。EtNADP-GDH在耐药株与敏感株中的转录水平和翻译水平总体来说变化都不明显,在使用不同浓度的药物作用下,也并没有引起该基因转录水平或翻译水平的显著变化。EtSOD在耐药株中的转录水平和翻译水平出现明显的上调,对不同浓度的地克珠利作用下诱导产生的柔嫩艾美耳球虫耐药株检测发现,该基因的转录水平和翻译水平与药物浓度呈正相关。对不同浓度的马杜拉霉素作用下诱导产生的柔嫩艾美耳球虫耐药株进行检测分析也发现了同样的结果。另外,对EtNADP-GDH和EtSOD进行酶活分析发现EtNADP-GDH酶活性在三种虫株中无明显变化,但EtSOD在两种耐药株中酶活性明显升高。
【学位授予单位】：上海师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.723
【图文】：

氨基酸序列,孢子化卵囊,柔嫩艾美耳球虫,次氯酸钠氧化

BLAST 程序（http://www.ncbi.nlm/www.expasy.org/tools/protparam.html） http ： //octopus.cbr.su.se/index.phpch/cgi-bin/motif_scan）对 EtNADP-G蛋白质的理论分子质量、等电点、氨氨基酸序列的功能结构域[53]。株孢子化卵囊虫体的收集与纯化艾美耳球虫后，收集 6~8 d 的粪便，钾溶液，在 28 ℃的条件下，对其通用饱和盐水漂浮法和次氯酸钠氧化法

PCR扩增,选择度,柔嫩艾美耳球虫,孢子化卵囊

柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊的 cDNA 的第一链为模板，选择度进行 PCR 扩增。琼脂糖凝胶电泳分析发现扩增所得的条带大小约为 1407 bp（图 2-2C）。连接至克隆载体 pGEM-T-easy 载体，转受态细胞 TOP10 后，使用质粒小提试剂盒，按照其使用说明书提GEM-T-EtNADP-GDH，质粒经限制性核酸内切酶 BamHI 和 SalI 双凝胶电泳分析发现与预期一致的 2 条带（图 2-3），表明重-T-EtNADP-GDH 构建成功，可用于后续实验。 EtSOD 基因的扩增及双酶切验证柔嫩艾美耳球虫敏感株孢子化卵囊的 cDNA 的第一链为模板，选择度进行 PCR 扩增。琼脂糖凝胶电泳分析发现扩增所得的条带大小约为 651 bp（图 2-2D）。连接至克隆载体 pGEM-T-easy 载体，转化态细胞 TOP10 后，使用质粒小提试剂盒，按照其使用说明书提取M-T-EtSOD，质粒经限制性核酸内切酶 BamHI 和 XhoI 双酶切后，泳分析发现与预期一致的 2 条带（图 2-3），表明重组质粒 pGEM-功，可用于后续实验。

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