山东省泰安市零售鸭产品中产气荚膜梭菌的分离鉴定、基因分型及耐药性研究

发布时间：2020-07-04 11:49

【摘要】：产气荚膜梭菌是一种重要的人畜共患病原微生物,一定条件下可引起人和动物的多种疾病。鸡和猪肉中产气荚膜杆菌的污染已经在世界范围内报道过,但是在鸭产品中却很少被报道,为了调查山东省泰安市某市场零售鸭产品中产气荚膜梭菌的污染状况以及分离株的血清型分布、耐药性和遗传演化规律,2018年3月至11月从零售市场主要的鸭产品零售商店采集鸭产品173份,环境样品10份,健康摊主的新鲜粪便7份。采集的样品经分离培养和初步鉴定后,用多重PCR鉴定分离株的血清型,通过纸片扩散法(K-B法)检测了分离株对12种(8类)常用抗菌药物的敏感性,并根据耐药表型检测了β-内酰胺类耐药基因blaCTX-M、blaTEM、blaSHV和四环素耐药基因Tet(M)、TetA(P)、TetB(P)。用16SrDNA对不同来源的部分菌株的进化关系进行了初步分析,并利用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)进一步分析了不同来源的产气荚膜梭菌的遗传相关性。分离培养结果显示:鸭产品,环境和健康人类粪便样品的产气荚膜梭菌阳性率分别为(48/173,27.70%),(10/10,100%)和(7/7,100%),共计分离到99株产气荚膜梭菌;血清型鉴定结果显示:所有分离株株均为A型产气荚膜梭菌;部分菌株16SrDNA序列分析结果显示:与NCBI上已上传的产气荚膜梭菌参考菌株序列的同源性为99%。毒素基因检测结果显示:在鸭源菌和人源菌中均检测到cpb2基因,阳性率分别为54.30%和33.33%,所有分离株均未检测到NetB毒素基因;肠毒素基因cpe只在人源菌株中检测到,阳性率为(1/7,14.30%)。药敏实验结果显示:90.10%的鸭源和环境分离株表现为多重耐药,耐药谱中主要包括磺胺异VA唑、杆菌肽、庆大霉素、林可霉素、红霉素、青霉素和四环素,鸭源分离株对头孢噻肟、头孢吡肟的耐药率均小于10%。在鸭源和环境分离株中检测到四环素耐药基因TetA(P)、Tet(M)和β-内酰胺类耐药基因blaCTX-M,阳性率分别为(34.60%,28/81)、(22.20%,18/81)、(4.90%,4/81);在人源菌中只检测到四环素耐药基因TetA(P),阳性率为(66.70%,12/18)。经过初步筛选,58株不同来源的产气荚膜梭菌被用于多位点序列分型(MLST),20组从NCBI上下载的健康儿童肠道分离株ST序列(ST45-ST64)也被用于分型。分型结果显示:58株产气荚膜梭菌产生了41个ST型和4个克隆复合群(CC1-CC4),4个克隆群占总菌株数的37.9%,其中CC1包括来自于四个零售商的肠内容物分离株、胴体分离株以及环境分离株,共计14个菌株,占总菌株的24.13%,是一个优势克隆复合群,其中又以ST11型最为常见,占总菌株的8.60%;部分人源分离株和鸭源分离株被分配在同一ST型(ST6)中。添加了ST45-ST64后,产生了3个新的克隆复合群(CC5-CC7),鸭源分离株和儿童分离株同时被分配到同一克隆群中。结论:泰安市鸭产品中产气荚膜梭菌的污染率较高,鸭源和环境分离株均为A型产气荚膜梭菌且分离株表现出广谱耐药性,多重耐药率高达90.10%;45株鸭源和环境分离株表现出了丰富的遗传多样性,产生了33个ST型和4个克隆复合群(CC1-CC4);MLST结果显示:可能存在交叉污染,并且零售商环境和鸭肠内容物是导致胴体污染的主要原因;鸭源、人源宿主的部分菌株系统发育关系相近,被分配同一个ST型或克隆群中,表明鸭源菌存在通过食物链传播给人类的风险。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS251.7;S852.61
【图文】：

图 2：产气荚膜梭菌分离株多重 PCR 电泳图；M:DL2000Marker；1：NCTC528；2：NCTC3180；3：NCTC8346；4：NCTC8084；5-18：产气荚膜梭菌分离株；19：空白对照ig.2: Multiplex PCR amplification of Clostridium perfringens isolates M: DL2000Marker; 1: NCTC52: NCTC3180 ; 3: NCTC8346; 4: NCTC8084; 5 -18: Clostridium perfringens isolates; 19: blank contro气荚膜梭菌分离株 cpb2 毒素基因检测鉴定为阳性的 99 株产气荚膜梭菌菌株，用 PCR 方法扩增分离株的 cpbR 结果显示：阳性对照和部分分离株成功扩增出了大小为 576bp 的条带条带（图 3）；在 52 株（64.20%）鸭源和环境分离株中检测到 cpb2 毒30%）人源分离株中检测到 cpb2 毒素(表 3）；扩增完成后，将 PCR 产测序结果显示：与 NCBI 上已上传的产气荚膜梭菌 cpb2 序列 Closs strain JGS1984 beta2 toxin (cpb2) gene（登录号：AY609174.1）的同源M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

图 2：产气荚膜梭菌分离株多重 PCR 电泳图；M:DL2000Marker；1：NCTC528；2：NCTC3180；3：NCTC8346；4：NCTC8084；5-18：产气荚膜梭菌分离株；19：空白对照ig.2: Multiplex PCR amplification of Clostridium perfringens isolates M: DL2000Marker; 1: NCTC5: NCTC3180 ; 3: NCTC8346; 4: NCTC8084; 5 -18: Clostridium perfringens isolates; 19: blank contr气荚膜梭菌分离株 cpb2 毒素基因检测鉴定为阳性的 99 株产气荚膜梭菌菌株，用 PCR 方法扩增分离株的 cpR 结果显示：阳性对照和部分分离株成功扩增出了大小为 576bp 的条带带（图 3）；在 52 株（64.20%）鸭源和环境分离株中检测到 cpb2 毒0%）人源分离株中检测到 cpb2 毒素(表 3）；扩增完成后，将 PCR 产测序结果显示：与 NCBI 上已上传的产气荚膜梭菌 cpb2 序列 Clos strain JGS1984 beta2 toxin (cpb2) gene（登录号：AY609174.1）的同源M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

【参考文献】

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本文编号：2741087