全人源抗Her2单克隆抗体转基因山羊的制备

发布时间：2020-07-05 01:48

【摘要】：根据CA Cancer J Clin的文章统计,2018年全球临床癌症的发病率中,乳腺癌居于女性恶性肿瘤发病率首位,在全球癌症发病率中也仅次于肺癌,显然乳腺癌是危害女性健康的第一大恶性肿瘤,其中Her2阳性转移性乳腺癌(metastatic breast cancer,MBC)在晚期乳腺癌占比中达到25%。人表皮生长因子受体 2(human epidermal growth factor receptor 2,Her2/ErbB2)是一种具有酪氨酸酶活性的跨膜蛋白,Her2的过表达往往与许多上皮细胞癌症的恶化密切相关。因此,将Her2作为靶位点治疗乳腺癌成为肿瘤治疗领域的研究热点。目前靶向Her2抗体药物主要有单克隆抗体、双特异性抗体、抗体偶联药物等。美国FDA于1998年批准了第一个用于Her2阳性转移性乳腺癌(metastatic breast cancer,MBC)临床治疗的单克隆抗体药物曲妥珠单抗(Herceptin(?))上市。传统单抗一般选择以具有天然活性蛋白的哺乳动物细胞为表达载体,以保证抗体蛋白的正确修饰和生物学活性。本研究选择以转基因山羊乳腺生物反应器为抗体表达方式,构建Anti-Her2乳腺特异性表达载体pDBC-Her2:含有两个以山羊β-casein为启动子和以牛BGH-PA为终止子的表达框。将Her2抗体的轻链与重链分别连入两个表达框中,该表达载体可通过Cre/loxp重组酶系统将外源目的基因定位整合入人溶菌酶转基因山羊细胞内。转染原代山羊乳腺上皮细胞后通过RT-PCR和Western Blot检测其细胞水平的cDNA/蛋白的表达,完成Anti-Her2乳腺特异性表达载体pDBC-Her2的构建。将构建完成的pDBC-Her2质粒与pBS185质粒共转染人溶菌酶山羊成纤维细胞,利用嘌呤霉素加压筛选获得阳性克隆,通过PCR和测序的方式鉴定其目的基因是否定位整合,筛选获得定位整合的阳性细胞株,同时也是制备转基因山羊的体细胞核移植供体。选择30头2岁龄的健康母关中奶山羊,其中20头为供体,10头为受体,控制同步发情,经过超数排卵和手术取卵后共获得卵母细胞177个,融合后获得重构胚92枚,通过手术移植入10头受体母羊体内。在移植35天后进行B超检查,共检查到2头母羊出现孕囊,怀孕率20%(2/10)。剖腹取出40日龄的羊胎儿,通过PCR和测序方法鉴定,胎儿的基因成功定位整合Her2抗体基因,该羊为pDBC-Her2转基因羊,为后续该转基因羊的扩繁埋下基础。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S827
【图文】：

本实验室之前已获得人溶菌酶转基因山羊，其标记基因框架为丨ｏｘｐｌ－ｎｅｏ－ＴＫ－ｌｏｘｐ，逡逑因此在此基础上，设计ｍｔＬｏｘｐ－Ｈｅｒ２－ｐｕｒｏ－ｌｏｘｐ载体，这样可以将Ｈｅｒ２目的基因定位整逡逑合入羊的基因中。置换方式示意图如图１－１。逡逑

１．材料与方法逡逑Ｕ材料逡逑羊Ｐ邋－ｃａｓｅｉｎ启动子相关序列来源于ＧｅｎＢａｎｋ：邋ＡＨ００１１９５．２，牛ＢＧＨ－ＰＡ终止子相关逡逑序列来源于ＧｅｎＢａｎｋ：Ａ０５１３７．１。ｐＢＣ－ＰＡ质粒由实验室之前构建并保存，Ｈｅｒ２轻链和重逡逑链序列来源于ＥＮＳＧ０００００１４１７３６。逡逑１．２数据分析软件逡逑（１）逦Ｐｒｉｍｅｒ５．０，邋ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｐｒｉｍｅｒｄｅｓｉｇｎ／逡逑（２）逦Ｃｈｒｏｍａｓ２．２．６？邋ｈｔｔｐｓ：／／ｃｈｒｏｍａｓ．ｕｐｄａｔｅｓｔａｒ．ｃｏｍ／逡逑２．逦结果逡逑２．１乳腺特异性表达载体ｐＤＢＣ－Ｈｅｒ２构建逡逑ＤＢＣ－Ｈｅｒ２２－１。逡逑

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本文编号：2741902