锚定表达猪IFN-λ3植物乳杆菌构建及体外抗猪PEDV、TGEV效果研究

发布时间：2020-07-06 09:41

【摘要】：乳酸菌作为一种具有益生功能的革兰氏阳性菌,能发酵碳水化合物。植物乳杆菌(Lb.plantarum)具有高黏附性及疏水性使其不但能在肠道定植,成为优势菌群,发挥其免疫调节活性,而且可以直接捕获病毒,起抗病毒作用。作为一种益生菌,将其作为载体递呈药物或保护性抗原蛋白,具有广泛应用。通过锚定蛋白作为表面展示原件,使外源蛋白锚定表达在新功能型植物乳杆菌表面,提高了外源蛋白的局部浓度并减少其在消化道的水解。猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)是两种肠道冠状病毒,能引起仔猪腹泻、脱水、呕吐等症状,具有较高的死亡率。两种病毒的共感染越发频繁,因此,开发一种新药用来预防和治疗混合病毒感染的仔猪腹泻尤为重要。Ⅲ型干扰素(IFN-λ)在上皮组织抗病毒初期起着重要的防御作用。IFN-λ通过Jak-STAT通路抑制病毒的感染和复制,上调通路下游的ISGs表达,使邻近健康细胞进入抗病毒状态。为了构建锚定表达猪IFN-λ3植物乳杆菌,将干扰素的抗病毒活性与乳酸菌的益生特性结合,发挥新功能型乳酸菌的抗病毒功能,本研究分为四个部分:(1)首先对CWA蛋白结构进行预测,获得锚定蛋白CWA,并构建锚定表达新功能型植物乳杆菌Lb.plantarum-pSIP-409-0373-EGFP-CWA(Lb.plantarum-409EC)。通过流式细胞术、Western Blot、直接免疫荧光等方法检测新功能型植物乳杆菌锚定EGFP的能力。测定最佳诱导条件和新功能型乳酸菌的生长速率等。(2)其次构建重组大肠杆菌BL21-pET-30a-IFN-λ3,经IPTG诱导后通过Western Blot验证目的蛋白成功表达在包涵体内。纯化、复性IFN-λ3蛋白并验证了其抗PEDV和TGEV的活性。(3)构建新功能型植物乳杆菌Lb.plantarum-pSIP-409-0373-IFN-λ3-CWA(Lb.plantarum-409IC)、Lb.plantarum-pSIP-409-pgsA′-IFN-λ3(Lb.plantarum-409P′I)并通过流式细胞术和Western Blot验证IFN-λ3在菌株表面表达成功,证明了CWA锚定方式比pgsA′能更高效的锚定表达猪IFN-λ3。(4)将诱导后的新功能型乳酸菌和IPEC-J2细胞共培养,并用PEDV和TGEV分别感染IPEC-J2细胞,通过实时荧光定量PCR(qPCR)证实,两种新功能型乳酸菌Lb.plantarum-409IC、Lb.plantarum-409P′I在不同浓度和时间点均可显著抑制PEDV、TGEV两种病毒在IPEC-J2中的RNA转录水平(0.01p0.05),且新功能型乳酸菌Lb.plantarum-409IC抑制病毒复制作用更强。通过间接免疫荧光证明与对照组相比,新功能型乳酸菌处理组在IPEC-J2/PEDV系统和IPEC-J2/TGEV系统中病毒载量明显降低。qPCR测定IPEC-J2细胞经新功能型乳酸菌Lb.plantarum-409IC刺激后,干扰素刺激基因:干扰素刺激基因15(ISG15)、抗粘液病毒基因(Mx1)、和干扰素诱导跨膜蛋白3(IFITM3)的相对表达量均明显上调。表明该新功能型乳酸菌可以通过提高IPEC-J2抗病毒基因的相对表达量,起到一定抑制病毒复制的作用。本研究证明了CWA和pgsA′两种蛋白都能将猪IFN-λ3锚定在植物乳杆菌表面,并发现新功能型乳酸菌Lb.plantarum-409IC抗PEDV和TGEV效果更强,本研究为新型乳酸菌制剂预防和治疗猪PEDV、TGEV感染奠定了一定基础。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.28
【图文】：

显微镜 DMi8（德国徕卡公司）；流式细胞仪 LSRFortessaTM（美国 BD 公司）；化学发光仪 Amersham Imager 600 System（美国 GE 公司）；荧光定量 PCR 仪applied biosystems 7500（美国 ABI 公司）。1.1.2 方法1.1.2.1 CWA 蛋白截短位置的确定利用 CWA 蛋白使报告基因表面展示在新功能型植物乳杆表面。很多研究表明了 CWA 蛋白的功能，但其较长的序列（2118bp）影响新功能型植物乳杆菌的构建和蛋白的定表达。因此本实验利用 Lasergene 软件推测 CWA 蛋白结构和截取位点。根据 CWA 蛋白表面可及性分析（图 2-1），该蛋白的中后部分可能为主要的蛋白展示功能区，而前面大部分不易展示蛋白。结合该蛋白的疏水性和抗原指数分析，其第 1536 bp 至 2118 bp 处位点可能为潜在的外源蛋白展示位点，从实际操作的角度考虑，将锚定蛋白缩短更有利于蛋白的展示，选择第 1536 碱基（512氨基酸位点）位点作为该蛋白的截短位点，共 582 个碱基。

图 2-3 pSIP-409-0373-EGFP-CWA 双酶切鉴定结果0 marker；1、3、5、7：新功能型质粒；2、4、6、8： XbaI 物ig.2-3 Identification of pSIP-409-0373-EGFP-CWAby double dig00 marker; 1, 3, 5, 7: new functional plasmid; 2, 4, 6, 8: XbaI andproductstern Blot 检测新功能型乳酸菌表面 EGFP 的表达情况estern Blot 检测新功能型乳酸菌Lb.plantarum-409EC可见与预期大小相符的目的条带。结果表明以 His 标约有大小为 54 kDa 蛋白印迹；第 7 泳道为空菌对照（作为一抗，第 1 泳道，目的条带为 54 kDa；第 2 道为型乳酸菌表面有 EGFP 表达（图 2-4）。

图 2-3 pSIP-409-0373-EGFP-CWA 双酶切鉴定结果M1：DL10000 marker；1、3、5、7：新功能型质粒；2、4、6、8： XbaI 和 Hind III 酶切物Fig.2-3 Identification of pSIP-409-0373-EGFP-CWAby double digestionM1：DL10000 marker; 1, 3, 5, 7: new functional plasmid; 2, 4, 6, 8: XbaI and Hind III digestioproducts1.2.2 Western Blot 检测新功能型乳酸菌表面 EGFP 的表达情况通过 Western Blot 检测新功能型乳酸菌Lb.plantarum-409EC表面 EGFP 表达水平，可见与预期大小相符的目的条带。结果表明以 His 标签作为一抗，1-6 泳道，约有大小为 54 kDa 蛋白印迹；第 7 泳道为空菌对照（A）。以 EGF单克隆抗体作为一抗，第 1 泳道，目的条带为 54 kDa；第 2 道为空菌对照（B显示新功能型乳酸菌表面有 EGFP 表达（图 2-4）。

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本文编号：2743471