牛ACADSB和CD44基因对脂肪代谢的调控作用

发布时间：2020-07-14 20:43

【摘要】：随着畜牧业的发展水平和人类生活水平的提高,消费者越来越重视牛肉和牛乳品质。牛肉品质和乳品质性状都是复杂经济性状,多基因共同调控其表型变化。随着后基因组学时代的到来,筛查与挖掘肉牛肉质性状和奶牛乳脂性状相关且具有重大遗传效应的候选功能基因,成为当前科研工作者主要挑战。基于课题组前期组学分析结果,ACADSB、CD44等基因可能对牛脂肪代谢具有重要的调控作用。本研究以ACADSB、CD44为候选基因,从分子水平出发,解析其与脂肪代谢的相关关系。以牛胎儿成纤维细胞、乳腺上皮细胞为研究对象,检测目的基因在mRNA和蛋白水平的表达情况,对细胞内甘油三酯、胆固醇和脂肪酸含量进行测定,同时利用PCR array技术,在细胞水平上验证ACADSB和CD44基因对牛脂肪代谢的影响。结果显示:ACADSB和CD44基因能够调控细胞内甘油三酯和胆固醇含量,并通过调控脂肪酸代谢通路的相关基因调节细胞内相关脂肪酸的含量。细胞内脂肪酸含量检测结果显示:在乳腺上皮细胞系中,ACADSB基因正向调控丁酸、己酸、十七烷酸、反式亚油酸的含量(P0.05);CD44基因负向调控硬脂酸含量,正向调控亚麻酸、顺式-8,11,14-二十碳三烯酸的含量。但在胎儿成纤维细胞中,ACADSB基因负向调控细胞内丁酸的含量(P0.05),正向调节细胞内十五烷酸和顺式-11,14-二十碳二烯酸的含量(P0.05);CD44正向调控二十二烷酸、棕榈酸和反式油酸的含量(P0.05),而负向调控细胞内十三烷酸、硬脂酸和顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸的含量(P0.05)。PCR array结果发现:CD44沉默调控ACADSB基因表达水平下调。利用CRISPR-Cas9技术,构建ACADSB和CD44基因敲除细胞系,并进行转录组测序,进一步验证候选基因功能并解析与脂肪代谢的相关关系。结果显示:候选基因敲除细胞系在mRNA和蛋白水平上的表达均显著降低,对细胞内甘油三酯和胆固醇的调控也与前期结果一致。转录组测序发现:部分脂肪酸代谢通路相关基因的表达水平也与PCR array结果相一致,进一步验证了ACADSB和CD44基因通过调控相关基因的表达,参与脂肪代谢进程。ACADSB基因敲除细胞系中差异基因蛋白互作关系预测分析发现:CD44基因被上调基因COL5A3和COL6A2以下调基因COL1A2、LAMC2、FN1和COL3A1共同激活,导致CD44表达下调。提示ACADSB基因的沉默,也导致CD44的表达水平下调。利用基因编辑技术,建立敲除小鼠模型,在动物活体水平上验证基因表达调控作用。结果表明:ACADSB基因和CD44基因敲除小鼠的生长、发育和繁殖正常。血清学检测结果发现:ACADSB和CD44基因基因敲除小鼠血清中甘油三酯的含量显著低于对照组(P0.05)。ACADSB基因敲除小鼠在乳腺和肌肉组织中甘油三酯的含量均降低,而胆固醇的含量并无明显变化;ACADSB基因敲除小鼠的脂肪组织中甘油三酯和胆固醇的含量均显著降低(P0.05)。CD44基因敲除小鼠的乳腺和肌肉组织中甘油三酯的含量降低,但在脂肪组织中,表现出明显的性别差异,在雌性小鼠的脂肪组织中甘油三酯的含量显著降低(P0.05),而在雄性小鼠的脂肪组织中,其甘油三酯含量显著升高(P0.05),具体的作用机制仍需进一步探讨。小鼠甘油三酯酶联免疫吸附实验结果显示:与对照组相比,ACADSB基因敲除的纯合型小鼠乳汁中甘油三酯含量降低(P0.05),而CD44基因敲除的纯合型小鼠乳汁中甘油三酯含量显著降低(P0.05)。ACADSB基因敲除小鼠组织中脂肪酸含量及成分的检测结果发现:在雄鼠的脂肪组织中,共检测到7种脂肪酸,纯合型与野生对照组相比,肉豆蔻酸、棕榈油酸、反式亚油酸、亚油酸、二十烷酸、亚麻酸、顺式-5,8,11,14-二十碳四烯酸的含量都增加,其中棕榈油酸、亚油酸、二十烷酸的含量均显著增加(P0.05),其脂肪酸含量的改变主要受到FABP3、FABP5和ACSL1等基因表达水平的调控。而CD44基因敲除小鼠组织中脂肪酸含量及成分的检测结果发现:在雄鼠的肌肉组织中,共检测到6种脂肪酸,纯合型与野生对照组相比,十三烷酸、油酸、亚油酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸的含量均降低,并且棕榈酸的含量显著低于对照组(P0.05),这些脂肪酸的改变主要是受ACOX2、FABP5、ACAD11等基因表达水平的调控。而在雌鼠的乳腺组织中,共检测到5种脂肪酸,纯合型与对照组相比,十一酸、棕榈酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸含量均降低,其中棕榈酸的含量显著减少(P0.05),其脂肪酸含量的变化,主要受FABP2、FABP1、ACSL5等基因表达水平的调控。为了探讨ACADSB和CD44及PRSS2基因是否具有可用于未来牛肉质和乳品质性状标记辅助选择的分子标记,本研究以中国西门塔尔牛和中国荷斯坦奶牛群体为研究对象,采用直接测序的方法进行候选基因遗传多态性的分析。多态性分析结果显示:ACADSB基因I8-54GA和I8-114GA位点与产奶量显著相关;E8-71CA、I8-106CG、I8-114GA和I8-54GA位点与乳糖含量显著相关;I7-3669G/T、I7-3974G/A、I8-118GA和I8-119GA位点与腰部肉厚和眼肌面积等肉质和胴体性状显著相关;I8-374CT位点与大腿肉厚、眼肌面积等肉质和胴体性状显著相关。CD44基因I11-1597GC位点与乳品质性状中的乳糖含量、乳蛋白率和干物质量显著相关。I12-112TC位点与产奶量、乳蛋白率、乳糖、校正奶量和乳脂率等乳品质性状显著相关。I11-1597GC位点与胴体重、屠宰率和肾脏脂肪量显著相关;I12-37CA位点与屠宰率和屠宰酸度显著相关;I12-112TC位点与屠宰率、背膘厚以及排酸后酸度显著相关;I16-8383 AG位点与屠宰率和眼肌面积显著相关。PRSS2基因I3-265GA、E4-31AT、E4-68GA、E4-78GC和I4-160TC位点与乳蛋白含量显著相关。I1-611CG、I1-668GA、I1-710GA和I1-819AG位点与眼肌面积的显著相关。ACADSB、CD44及PRSS2基因多态性位点均与牛肉质和乳品质性状相关,可以作为遗传标记应用到牛的遗传育种的过程。本研究在前期转录组学分析的基础上,以ACADSB和CD44为候选基因,在细胞水平上验证候选基因对细胞内甘油三酯、胆固醇、脂肪酸含量的影响,以及对相关基因的调控作用;并构建了敲除小鼠模型,在动物水平验证敲除基因对肌肉、乳腺及脂肪组织中甘油三酯、胆固醇和脂肪酸含量的影响,探讨了ACADSB和CD44等基因的SNPs位点作为遗传标记应用于牛的分子育种。本研究为奶牛、肉牛脂肪性状的选择和新品种的培育提供基因资源和理论基础。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S823.2

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