猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白B细胞线性表位的鉴定及其与宿主蛋白相互作用

发布时间：2020-07-16 02:20

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是严重危害养猪业的病原。PRRSV的非糖基化M蛋白是最保守的结构蛋白,在病毒粒子中M蛋白和GP5以二硫键相连形成的异源二聚体是PRRSV感染必须的。本研究通过制备M蛋白单克隆抗体,鉴定其识别的表位,筛选与M蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,进一步分析M蛋白与宿主细胞蛋白NF45的相互作用及其对PRRSV复制的影响,以期为揭示M蛋白在PRRSV感染与免疫中的生物学功能提供科学依据。用超速离心纯化的PRRSV HuN4-F112免疫6周龄BALB/c雌性小鼠,取脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。利用间接免疫荧光试验(IFA)筛选阳性杂交瘤细胞,经亚克隆获得2株分泌抗PRRSV M蛋白单克隆抗体(MAb)的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为1C8和3F7,其IFA效价均能达到1：512。亚类鉴定结果表明,1C8和3F7分别为IgG2a和IgG1亚类。Westernblot分析显示,2株单抗均能与PRRSV M蛋白特异性结合。阻断ELISA分析表明,1C8和3F7与PRRSV的反应能被PRRSV阳性血清阻断。利用制备的2株M蛋白单克隆抗体,对M蛋白进行了抗原表位的鉴定。首先将M蛋白截短为相互重叠的4段,进行Western blot分析。结果显示,单克隆抗体1C8识别MF1(aa1-55),单克隆抗体3F7识别MF4(aa121-174);进一步对这两段分别截短为8段,最后经寡核苷酸直接退火连接到表达载体进行表达,结果显示1C8识别M蛋白的aa3-6(3SSLD6),3F7识别M蛋白的aal55-163(155VLGGRKAVK163)。研究结果表明,单克隆抗体1C8和3F7识别的表位为首次确认的M蛋白线性表位。氨基酸序列比对显示,鉴定的2个表位在基因2型毒株中高度保守,而在基因1型毒株中存在缺失和突变。利用M蛋白单克隆抗体,采用免疫共沉淀(Co-IP)结合串联质谱(LC-MS/MS)方法,筛选与PRRSV M蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,并对筛选出的细胞蛋白进行生物信息学分析。结果表明,与对照组相比,PRRSV HuN4-F112感染组共存在10条差异表达的蛋白条带,将10条蛋白胶条带进行串联质谱分析,鉴定出285个(UniquePepCount≥2)与M蛋白相互作用的宿主蛋白,这些蛋白主要与蛋白翻译、病原致病、信号传导等细胞通路存在密切的关系。将分别携带HuN4-F112-M和NF45的真核表达载体共转染293T细胞,利用免疫共沉淀和激光共聚焦技术验证了PRRSV M蛋白与宿主细胞蛋白NF45的相互作用和共定位情况。将PRRSV HuN4-F112感染MARC-145细胞,利用M蛋白单克隆抗体3F7进行免疫共沉淀,在免疫复合物中也能检测到NF45蛋白,表明M蛋白和NF45蛋白在病毒感染情况下也具有相互作用。利用siRNA沉默MARC-145细胞中NF45基因的表达后,再感染PRRSV,采用Western blot和病毒滴度测定分析NF45对PRRSV增殖的影响。结果表明,抑制NF45的表达能降低子代病毒的产量和病毒M蛋白的表达,提示宿主细胞蛋白NF45参与PRRSV的复制。综上所述,本研究鉴定出存在于PRRSV M蛋白的2个新表位aa3-6和aa155-163,筛选出与PRRSV M蛋白互作的宿主细胞蛋白,并绘制出蛋白互作图谱,证实了PRRSV M蛋白与宿主细胞蛋白NF45具有相互作用,并揭示了NF45在PRRSV增殖中的生物学意义。研究结果丰富了M蛋白的抗原结构,并为深入研究M蛋白与宿主细胞蛋白相互作用的分子机制及其生物学意义提供了重要依据。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.65
【图文】：

超速离心,染色体数

别基W 2别HP-PRRSV HuN4及疫苗株HuN4-Fl丨2、JXA1-R、TJM-F92,而不能识别基闪1嘲VP046 BIS和DV株（图2-1A) , 3F7单抗能够识别基因2R%HP-PRRSV HuN4.疫苗株HiiN4-Fl 12、JXA1-R, TJM-F92 和基网 1 型 VP046 BIS,而不能识别基闪 1 型 DV 株（图 2-2B)。2.3.3杂交瘤细胞的染色体鉴定经秋水仙素法检测，SP2/0细胞的平均染色体数为55-65，BALB/C小鼠脾细胞的染色体数为40，而彡々交瘤细胞的平均染色体数为95-105。结果证实，获得的彡j!；交瘤细胞为融合所得（阁2-3)。14

单克隆抗体,特异性,蛋白,轻链

特性的鉴定盒对单克隆抗体的I类和轻链耶进行了鉴定。结果显示类，轻链均为K链C表2-丨）。表2-1单克隆抗体的类型鉴定Table 2-1 Identification of MAbs subclass and subtypesIgG2a IgG2b IgG3 IgA IgM 0.254 0.059 0.08 0.057 0.058 0.054 0.054 0.053 0.054 0.055 分析单克隆抗体的特异性4-F112接种MARC-145细胞，并设细胞对照，48 h时收CA测细胞总蛋白浓度，将相同的蛋内tt进行SDS-PAG、GP3单抗和制备的2株M蛋内单克隆抗体进行检测。特异性地识别HLiN4-F112的M蛋白（图2-4)。lluN4-FII2 - +

截短,PCR扩增,PCR鉴定

图3-1 0RF6及其截短片段的PCR扩增Fig. 3-1 PCR-amplifled products of PRRSV ORF6 and truncated segments3.3.2各基因片段原核表达载体的单、双酶切及PCR鉴定

【参考文献】