烟酰胺对围产期奶畜糖脂代谢及其子代肠道发育的影响和机制

发布时间：2020-07-16 15:21

【摘要】：围产期又称过渡期,是奶畜泌乳周期中的特殊生理时期,一般包括围产前期(产前21 d)和围产后期(产后21 d)两个阶段,该时期奶畜不仅经历妊娠-分娩-泌乳的生理变化,也经历饲粮转换、环境和管理等改变,是能量负平衡和代谢紊乱性疾病多发阶段。围产期奶畜的营养代谢状态不仅影响奶畜本身,对子代的生长发育具有短期或长期的深远影响。子代早期培育是养殖过程的重要环节,研究表明母体效应不仅与遗传信息有关,还与母体环境和营养水平密切相连。生物素(BIO)是糖异生限速酶的辅因子,烟酰胺(NAM)是烟酸(NA)的酰胺形式,NA进入体内将转换成NAM。NAM是能量代谢辅酶I和II的重要前体物,参与机体合成和分解代谢,显著调控糖脂代谢相关途径,目前已在奶畜研究中受到关注,但BIO和NAM对围产期奶牛的代谢调控尚不明确;且围产期不同阶段进行营养干预的效果差异及其对子代生长发育的影响未见报道。因此本研究在探究BIO和NAM对围产期奶牛糖脂代谢影响的基础上,进一步研究了NAM在围产期不同阶段的添加对奶畜生产性能及相关代谢参数的影响,利用代谢组学和转录组学的系统生物学方法,分别对奶畜血液、乳代谢物质的变化,以及肠道、肝脏组织关键代谢功能的差异进行探究,以挖掘NAM调控围产期奶牛和奶山羊能量代谢及其母子营养效应的可能机制。试验一围产期奶牛补饲生物素和烟酰胺的生产性能和血液生化指标葡萄糖是反刍动物可利用的快速有效的能量物质。BIO和NAM可作为辅因子共同参与肝脏糖异生。为明确BIO和NAM对围产期奶牛生产性能和能量代谢的影响,本研究选取健康二胎次的中国荷斯坦围产期奶牛40头,配对分成4组,分别为:对照组(T_0),BIO组(T_B,30 mg/d),NAM组(T_N,45 g/d),和BIO+NAM组(T_(B+N),30mg BIO/d+45 g NAM/d)。奶牛采食相同的基础日粮,添加剂以灌服的方式于每日07:00进行补饲。试验期为产前14 d至产后35 d。本试验中,补饲BIO和NAM可分别提高血浆中BIO和NAM含量,混合添加并未引起额外的含量变化。BIO对围产期奶牛干物质采食量(DMI),能量平衡和犊牛出生重无影响,NAM有增加产前DMI的趋势。BIO和NAM对产奶量无影响,但在乳糖含量和乳脂产量上存在交互作用的趋势。BIO显著降低血浆甘油三酯(TG)含量,NAM显著提高血糖浓度,降低TG、非酯化脂肪酸(NEFA)、β羟基丁酸(BHBA)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL),且存在BIO、NAM和时间对能量平衡和NEFA影响的交互效应。胰岛素和总胆固醇(TC)含量不受影响。综上所述,NAM可提高围产期奶牛的血糖浓度,影响脂质代谢,BIO对围产期奶牛的生产性能等无影响;BIO和NAM共同添加时,NAM仍可保持体内葡萄糖稳态和对脂质的影响。试验二围产期奶牛补饲生物素和烟酰胺的代谢机理在试验一结果的基础上,本研究拟应用血液代谢组学探究BIO和NAM影响围产期奶牛糖脂代谢的潜在营养机制,以及代谢调控通路。试验设计同试验一,选择围产期奶牛产后14 d的血清,从每个试验组中随机选择8个样本进行试验测定和分析,采用气相色谱-飞行时间质谱进行代谢组学分析。试验组(T_B、T_N和T_(B+N))分别与对照组(T_0)进行比较分析。与T_0相比,T_B、T_N和T_(B+N)均显著升高了血糖,而T_N和T_(B+N)组的NEFA和T_(B+N)组的TG显著降低,T_(B+N)组的ATP明显升高,T_N和T_(B+N)显著提高了谷胱甘肽和减少了活性氧的浓度。此外,T_B显著增加了肌苷和鸟苷的浓度,并降低了β-丙氨酸等。T_N和T_(B+N)均显著降低了脂肪酸浓度(包括亚油酸、油酸等),部分氨基酸衍生物(T_N中的精胺、T_(B+N)中的腐胺和4-羟基苯乙醇以及T_N和T_(B+N)中的胍丁二酸)也受到不同程度的影响。相关性网络分析表明,添加NAM对代谢产物的影响集中在糖脂代谢,代谢物之间关联更多。综上所述,BIO和NAM可促进围产期奶牛的氨基酸代谢和糖异生,NAM增强葡萄糖代谢;结合试验一结果可得NAM通过影响不饱和脂肪酸的生物合成减少血液脂肪酸含量,并缓解围产期奶牛的氧化应激。试验三围产期不同阶段添加烟酰胺对母羊生产性能及生化指标的影响前期试验表明NAM对围产期奶牛糖脂代谢的调控作用优于BIO,因此,本试验将进一步探究NAM的作用机理。奶畜在围产前期和后期的生理状态不同,包括能量平衡状态和机体代谢等。围产期奶山羊存在NEB,且母体的能量平衡和营养状态对子代的生长发育具有短期和长期的重要影响,本研究拟利用围产期奶山羊及其羔羊为模型,明确围产期不同阶段添加NAM的作用效果,为后续羔羊生长发育的影响研究提供支持。肝脏是重要的能量代谢器官,在奶畜能量和糖脂代谢中发挥重要作用,因此,利用肝脏代谢组学和转录组学解析围产期奶山羊不同阶段补饲NAM对肝脏组织基因表达和代谢功能的影响,旨在阐明NAM调控肝脏代谢的可能机制。试验选取健康二胎次妊娠关中奶山羊15只,配对分为3组,每组5只,分别记为对照组(C),产后添加NAM组(P)和全期添加NAM组(EP)。NAM添加量为5 g/d,采用灌服的方式添加。试验期从产前21 d至产后28 d。肝脏组织利用GC-TOF/MS和Illumina HiSeq 4000进行测定,处理组两两比较并分别命名为C_(P:C),C_(EP:C)和C_(EP:P)。试验结果表明:(1)NAM对围产期奶山羊的DMI和泌乳性能无显著影响。NAM有降低血液中NEFA和TG的趋势,但对血糖和TC无影响。(2)腹脂中,TG含量在EP处理组中极显著减少,NEFA含量在P和EP处理组中均极显著减少,而TC含量随NAM添加时间的延长显著降低。NAM有提高ATGL活性的趋势,趋于降低二脂酰甘油酰基转移酶2(DGAT2)的活性。(3)肝脏中,NAM显著降低了甘油的含量,而脂肪三酰甘油酯酶(ATGL)的活性随NAM的添加显著升高。TG有降低的趋势,极低密度脂蛋白(VLDL)含量、丙酮酸激酶(PK)和磷酸甘油酰基转移酶6(AGPAT6)的活性有增加的趋势。EP组的葡萄糖转运载体2(GLUT2)和AGPAT6的基因表达量显著升高。(4)C_(P:C)的差异基因无显著GO富集的生物学过程,C_(EP:C)中主要与脂质代谢,甘油三酯分解、RNA代谢、蛋白质的组装、合成和定位等相关,C_(EP:P)和C_(EP:C)的GO富集过程类似,但对脂质相关代谢无影响。C_(P:C)的差异基因无显著富集的KEGG代谢通路,C_(EP:C)中差异表达基因显著富集核糖体代谢、代谢疾病相关代谢和氧化磷酸化等能量代谢,除此之外,全期添加NAM还可调控肝脏细胞黏附连接。代谢组结果显示,C_(P:C)中胱氨酸、β-氨基异丁酸、胞苷酸代谢产物、前列腺素、双甘油含量显著降低,丙二酰胺显著提高;C_(EP:C)中,d-甘油酸、鸟嘌呤核苷、9-十六碳烯酸、氨乙基膦酸、3-氨基异丁酸、胞苷酸、次黄嘌呤、前列腺素、丙二酸、硫酸、3-甲氨基-1,2-丙二醇含量显著降低,尿嘧啶和十八醇显著提高;C_(EP:P)中,丙二酰胺含量显著降低,腺嘌呤显著提高。在C_(P:C)中嘧啶代谢和半胱氨酸和蛋氨酸代谢显著富集,在C_(EP:C)中,除了嘧啶代谢,我们还发现了嘌呤代谢、硫代谢、甘油脂代谢、泛酸和辅酶A生物合成、已醛酸和二羧酸代谢、β-丙氨酸代谢、甘氨酸,丝氨酸和苏氨酸代谢也被显著富集,C_(EP:P)中无显著富集的代谢通路。因此,围产期奶山羊从产前添加NAM可促进肝脏葡萄糖的转运和利用;NAM促进围产期奶山羊腹部脂肪分解供能,并通过提高肝脏中TG的分解和以VLDL形式的转运减少TG在肝脏中的蓄积,从而保证肝脏健康。NAM对肝脏代谢的调控主要为脂质代谢、氨基酸代谢通路和核苷酸代谢等,不同阶段补充NAM对围产期奶山羊肝脏的转录调控差异明显,但对代谢物及代谢通路影响较小,NAM在围产期从产前添加对肝脏代谢的调控更有利。试验四母羊围产期不同阶段添加烟酰胺对乳代谢物和子代肠道功能的影响结合前期研究和试验三的结果,本试验利用代谢组学和转录组学方法分别解析围产期奶山羊添加NAM对乳中代谢物和子代肠道发育的影响,以期阐明NAM引起的母体效应及可能机制。试验设计在试验三的基础上,将母羊产羔后其对应组(C、P和EP)的羔羊分别命名为L_C组、L_P组和L_(EP)组。根据羔羊出生重等每组选择5只羔羊(公母比2:3,每只母羊有1只羔羊),人工哺喂对应母乳至产后28 d。分别选择产后14 d和羔羊空肠黏膜组织利用GC-TOF/MS和Illumina HiSeq 4000进行代谢组和转录组测定,处理组两两比较,乳代谢物的比较分别命名为C_(P:C),C_(EP:C)和C_(EP:P)。试验结果表明,NAM提高了乳总抗氧化能力,全期添加减少了乳中细胞因子IL-1β的含量。C_(P:C)和C_(EP:C)中乳甘油含量显著降低,C_(EP:C)和C_(EP:P)中柠檬酸和蔗糖浓度显著升高,C_(P:C)中核糖含量有增加的趋势,而C_(EP:P)中核糖含量显著降低,说明核糖含量在P组中含量最高,肌醇在C_(EP:P)中显著升高。甘油脂代谢和半乳糖代谢在C_(P:C)和C_(EP:C)均被富集,C_(EP:C)中还增加了淀粉和蔗糖代谢的富集途径,在C_(EP:P)中,抗坏血酸和醛酸代谢、半乳糖代谢、戊糖磷酸途径和肌醇磷酸代谢均被富集。空肠黏膜转录组显示,有机酸和脂质代谢的生物学过程发生变化,NAM调控维生素代谢、脂肪酸代谢和肠道的免疫功能,除此之外,全期添加NAM还可调控肠道的细胞代谢和氨基酸代谢。因此,围产期母体添加NAM可促进羔羊肠道消化吸收和发育,产后阶段补充的NAM通过引起母乳的代谢变化发挥了重要的作用,NAM从产前开始添加对肠道吸收功能的影响更多,增强并丰富了羔羊早期肠道的功能发育。综上所述,本研究表明,(1)能量代谢方面:围产期奶牛补饲BIO和NAM可增强糖异生,NAM可促进葡萄糖利用,加快葡萄糖的代谢;此外,NAM通过降低不饱和脂肪酸的生物合成,促进腹部脂肪的分解供能,通过提高肝脏中TG的分解和以VLDL形式的转运减少TG在肝脏中的蓄积;NAM可提高乳抗氧化能力,并通过谷胱甘肽代谢缓解氧化应激等,从而保证围产期奶畜的健康;(2)母体营养方面:母体添加NAM可通过调控乳代谢物影响羔羊肠道消化吸收和发育,从产前添加增强和丰富了肠道的功能发育(3)添加阶段:NAM对围产期奶畜的能量代谢和子代肠道发育的营养调控应从产前开始。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.2
【图文】：

负平衡,脂质代谢,奶牛,肝脏

期奶畜经历妊娠－分娩－泌乳的生理代谢变化，机体需要大量的营nton and Waldron, 2004），但由于胎儿对瘤胃的物理性压迫以及体内瘦的影响，产犊时期干物质采食量（dry matter intake, DMI）急剧下降量低于机体消耗量，无法满足奶畜的营养需求，奶牛处于能量负平衡（alance, NEB）状态，且 NEB 主要发生在围产后期（余超，2016；Schaff et，还包括蛋白质和代谢葡萄糖负平衡等（Sun et al., 2016）。在余超（后能量摄入仅占能量需要量的80%，且产犊初期蛋白质负平衡较NE于 NEB 时，机体将主动进行体脂动员，通过脂肪组织释放大量非酯sterified fatty acids, NEFA）进入肝脏代谢，完全氧化生成 CO2和 H2O能量以缓解 NEB。然而，肝脏对 NEFA 的代谢能力有限，使得部分全氧化形成酮体，主要是 β 羟基丁酸（β-hydroxybutyric acid, BHBA），还易诱发酮病；此外，过多的NEFA会再酯化形成甘油三酯（triglycer能及时与极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）结合在肝脏积累导致肝脏脂肪浸润，严重时诱发脂肪肝，降低肝脏健康legel et al., 2012; Weber et al., 2013），如图 1-1。

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奶畜将处于氧化应激状态（Castillo et al., 2015; Sharm（Sordillo et al., 2009），多发能量代谢障碍性疾病，如乳，制约产后泌乳性能（Sordillo, 2005; Sordillo and Raphael围产期处于 NEB 和发生炎症之间的关系。除此之外，当围脂肪动员将加强，加剧奶畜处于氧化应激的可能性和程度奶期作为泌乳前奶畜恢复体况和蓄积体力的重要阶段，其过围产期也具有重要影响（DoAmaral et al., 2011; Rastani 代谢疾病如真胃移胃、产褥热和乳房炎等的发病几率也相奶畜的健康是多种因素相互作用产生的结果。美国明尼苏0 d 约有 24%的奶牛相继淘汰，如图 1-3。因此，应该合理改善围产期奶畜的健康（姚军虎等，2016）。

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奶畜的健康是多种因素相互作用产生的结果。美国明尼苏60 d 约有 24%的奶牛相继淘汰，如图 1-3。因此，应该合理改善围产期奶畜的健康（姚军虎等，2016）。图 1-2 奶牛能量负平衡与炎症（Esposito et al., 2013） 1-2 The relationships between negative energy balance and inflammation

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