低蛋白日粮和亮氨酸对氨基酸转运体和mTORC1通路作用的研究

发布时间：2020-07-17 20:27

【摘要】：均衡的日粮蛋白和氨基酸不仅有利于猪的生长、发育和繁殖,也可以提高饲料效率和减少对环境的污染。氨基酸通过激活mTORC1信号通路来影响蛋白质的合成,氨基酸不能自由通过细胞膜,需要细胞膜上氨基酸转运体的协助才能完成转运。溶酶体膜是mTORC1被氨基酸激活的场所,其上的氨基酸转运体SLC38A9和SLC36A1除了转运氨基酸外,还以氨基酸感应复合体来感应氨基酸并激活mTORC1信号通路。本研究旨在确定低蛋白日粮对氨基酸转运体和mTORC1信号通路相关基因的表达量的影响,阐明SLC38A9和SLC36A1感应氨基酸和调节mTORC1信号通路的机制。主要研究结果如下:1.利用定量PCR芯片等技术分析在低蛋白日粮处理下,氨基酸转运体和mTORC1信号通路相关基因在猪背最长肌中的表达量变化。结果显示,饲喂25 d和45 d时,与20%粗蛋白(标准水平)日粮相比,降低3%粗蛋白并保证赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸和色氨酸的含量不变,氨基酸转运体的表达量、背最长肌的重量以及mTOR和S6K1的磷酸化水平均没有差异变化。饲喂25 d时,与20%和17%粗蛋白日粮组相比,14%粗蛋白日粮组的氨基酸转运体SLC38A2、SLC1A7、SLC7A5、SLC16A10和SLC3A2表达量显著(P0.05)升高,并且在聚类分析中聚为一类,mTOR和S6K1的磷酸化水平和背最长肌重量降低。低浓度氨基酸培养基处理分化成肌管的C2C12细胞,氨基酸转运体SLC7A1、SLC7A5、SLC3A2、SLC38A2和SLC36A1的mRNA水平表达量升高,mTOR和S6K1的磷酸化水平下降。表明适当降低日粮蛋白水平(降低少于3%)不影响氨基酸转运体的表达与背最长肌的蛋白合成和重量,但是日粮蛋白水平过低(降低超过3%)和缺乏氨基酸促进氨基酸转运体的表达,抑制mTORC1的活性导致蛋白质合成受阻和背最长肌重量下降,从而影响猪的生长性能。2.构建SLC38A9和SLC36A1超表达载体并合成干扰片段,利用QPCR、免疫荧光和免疫共沉淀等技术分析SLC38A9和SLC36A1的相互作用,以及对mTOR定位溶酶体膜和磷酸化水平的影响。结果表明在正常状态下,SLC38A9和SLC36A1相互结合和相互影响对方的表达和定位,并且从溶酶体膜上释放失活的mTOR至细胞质并促进mTORC1信号通路的活性;缺乏氨基酸时,SLC38A9和SLC36A1的表达量升高,但SLC38A9和SLC36A1的结合能力减弱,此时mTOR从溶酶体膜移动至细胞质,活性被抑制;添加亮氨酸后,SLC38A9和SLC36A1的表达量升高,两者的结合能力增强,此时mTOR从细胞质定位到溶酶体膜并被激活。利用免疫共沉淀和LC-MS/MS分析得到与SLC38A9相互作用的蛋白,KEGG通路分析表明这些蛋白主要参与到与氨基酸感应和蛋白质合成相关通路中,比如mTOR信号通路、核糖体、内质网中蛋白质加工和AMPK信号通路。3.利用双荧光素酶试验和ChIP-PCR得出猪SLC38A9启动子区域存在两个AARE并且都与ATF4结合,第一内含子处的AARE位于SLC38A9的核心启动子区域。构建ATF4超表达载体并合成干扰片段,QPCR结果显示ATF4在转录水平调控SLC38A9的表达。在缺乏氨基酸处理下,ATF4的表达量下降而SLC38A9的表达量上升,添加亮氨酸时两者的表达量均上升。表明在缺乏氨基酸的条件下mTORC1被抑制导致其下游ATF4的表达和蛋白质合成下降,而ATF4与SLC38A9上的AARE的结合增强,进而使SLC38A9的表达量上升;添加亮氨酸后,mTORC1信号通路被激活,蛋白合成增加,ATF4被激活后促进氨基酸转运体的表达,SLC38A9的表达量升高进一步促进mTORC1信号通路的活性。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S816
【图文】：

动态平衡,氨基酸,日粮,蛋白质含量

华中农业大学 2019 届博士研究生学位（毕业）论文化合物的形式排出。日粮中的蛋白质含量过低不利于猪的生长和发育，蛋白质含量过高不能被吸收，形成氨气污染空气，变成粪便污染河流(Milgen and Dourmad 2015,Wu 2014)。根据饲料的高成本和环境因素，调整日粮中蛋白质和氨基酸含量，提高猪饲料效率从而得到优化和可持续发展的猪肉生产系统是非常有意义的。

低蛋白日粮,猪骨骼肌,能量代谢,氨基酸

蛋白质合成(Deng et al 2009, Duan et al 2016, Li et al 2017, Liu et al 2015)、能量代Li et al 2017)、脂肪沉积(Duan et al 2016, Fan et al 2017, Jiao et al 2016, Li et al 20opes et al 2017, Madeira et al 2013)、肠道微生物群(Fan et al 2017, Qiu et al 2017)、合物排放(Li et al 2015, Liu et al 2017)和氨基酸转运体表达(Li et al 2017)等，在低日粮中添加氨基酸可以改善低蛋白带来的一些负面作用(Che et al 2017, Deng e009, Jiao et al 2016, Li et al 2015, Li et al 2017, Madeira et al 2014, Otto et al 20eng et al 2016)（表 1-1）。研究表明信号通路参与低蛋白日粮影响猪营养物质代谢制 IGF-1/mTOR 通路可抑制蛋白质的合成，激活 FOXO1/MAFbx/MuRF1 通路促白质降解，AMPKα 通路可影响能量代谢(Li et al 2017)（图 1-2）。低蛋白日粮通TOR 通路抑制蛋白质合成的关键是氨基酸的转运和代谢，机体对于氨基酸水平的适应性反应主要表现在氨基酸转运体表达量的变化(Humphrey et al 2004)。在氨基酸的情况下，越来越多的氨基酸转运体被报道参与到 mTORC1 信号通路中同调节肌肉蛋白质的合成(Liu et al 2017, Liu et al 2016)。

低蛋白日粮和亮氨酸对氨基酸转运体和mTORC1通路作用的研究

mTOR参与mRNA翻译Fig.1-3mTORregulatesmRNAtranslation

【参考文献】