四川部分地区山羊腹泻主要病原菌检测及山羊源志贺菌部分生物学特性研究

发布时间：2020-07-18 04:10

【摘要】：山羊腹泻是山羊以拉稀为主要临床症状的一类疾病的总称,7日龄以内的羔羊表现最为严重,多种因素可以引起山羊腹泻,其中细菌性腹泻最常见,主要病原菌有产肠毒素大肠杆菌、沙门菌、志贺菌和奇异变形杆菌等。以上单一病原菌可以引起山羊腹泻,但常见多种病原菌混合感染。对引起山羊腹泻的重要病原菌尽早做出准确检测,并采取有效的预防和治疗措施是控制本病的关键。本研究首先建立同时检测产肠毒素大肠杆菌、沙门菌、志贺菌和奇异变形杆菌这4种病原菌的多重PCR方法,并用该方法对从四川部分地区采集的山羊肛拭子样本进行检测,同时分离鉴定4种病原菌,研究分离菌的耐药性,为山羊细菌性腹泻的药物防治提供参考;研究山羊源志贺菌的主要生物学特性,丰富其病原学研究资料。研究结果如下:(1)山羊腹泻4种病原菌多重PCR方法的建立及应用本研究针对产肠毒素大肠杆菌(ETEC)K99基因,沙门菌invA基因,志贺菌侵袭性质粒H ipaH基因和奇异变形杆菌ureR基因设计4对特异性引物,通过引物浓度和退火温度的优化,确定最佳引物浓度、退火温度、反应体系和反应条件,通过特异性、敏感性和重复性评价,建立同时检测引起山羊腹泻的4种主要病原菌的多重PCR方法,并应用该方法检测山羊粪便样品。结果显示多重PCR扩增目的条带大小与预期片段大小相符;对魏氏梭菌等6种肠道细菌均无扩增,表明该方法特异性好;该方法对ETEC、沙门菌、奇异变形杆菌和志贺菌检测的敏感性分别为10~3 CFU/mL、10~2 CFU/mL、10~2 CFU/mL和10~3 CFU/mL;该方法稳定性和重复性好;应用建立的多重PCR方法对21份山羊腹泻临床样品的检测结果与细菌分离鉴定结果一致,无漏检。本研究建立了特异、灵敏和重复性好的检测山羊腹泻4种病原菌的多重PCR方法,为山羊腹泻4种病原菌的快速检测提供了可靠的检测手段。(2)山羊腹泻4种病原菌的多重PCR检测、分离鉴定及耐药性检测本研究采用已建立的多重PCR方法对158份山羊腹泻肛拭子和68份健康肛拭子提取的DNA进行检测,并对多重PCR检测阳性的样本进行4种病原菌的分离鉴定,同时分析分离菌株对18种常用抗菌药物的敏感性。结果ETEC、沙门菌、志贺菌和奇异变形杆菌在158份腹泻样本中的多重PCR检出率分别为69.6%(110/158)、21.5%(34/158)、41.8%(66/158)、17.8%(28/158);在68份健康样本中的检出率分别为22.0%(15/68)、11.7%(8/68)、0%(0/68)、11.7%(8/68)。细菌分离鉴定结果显示,158份腹泻样本中,ETEC分离率为58.8%(93/158),沙门菌分离率为15.2%(24/158),志贺菌分离率为34.2%(54/158),奇异变形杆菌分离率为11.0%(17/158);68份健康样本中,ETEC分离率为16.1%(11/68),沙门菌分离率为11.7%(8/68),奇异变形杆菌分离率为8.8%(6/68),健康样本中没有分离到志贺菌。腹泻样本中4种病原菌的PCR检出率和分离率都高于健康样本,其中腹泻样本的ETEC和志贺菌多重PCR检出率和分离率极显著高于健康样本,由此可以推断ETEC和志贺菌是引起四川部分地区山羊细菌性腹泻最主要的病原菌。药敏试验结果表明,4种病原菌对18种常用抗生素耐药性都十分严重,最多为14重耐药,4种病原菌仅对头孢噻肟、大观霉素、丁胺卡那、头孢拉定4种抗生素共同高度敏感,4种病原菌对其余14种抗菌药物呈不同程度的耐药。(3)山羊源志贺菌的血清型鉴定、毒力基因检测及其对小鼠的致病性对分离鉴定的54株山羊源志贺菌进行血清学分型;PCR检测其携带的,sat、sen、setA、pic、sigA、icsP、ial、iusA、iutA、ipaH共10个毒力基因的情况;对携带毒力基因最多的优势血清型菌株采用灌胃法检测其对BALB/c小鼠的致病性。结果54株山羊源志贺菌均为福氏志贺菌,其中4株为福氏1 a血清型,11株为福氏1 b血清型,28株血清型为福氏2 b血清型,11株血清型为福氏3 b血清型,其中福氏2 b血清型为优势血清型。54株志贺菌均100%携带sat、sen、ipaH基因,而setA、pic、sigA、icsP、ial、iusA、iutA基因的携带率分别为73.6%、65.2%、65.2%、77.8%、82.0%、79.1%、79.1%;54株山羊源志贺菌中,最少携带4个,最多携带所有检测的10个毒力基因。携带10个毒力基因的4株福氏志贺菌2b优势血清型菌株均在1.7×10~8 CFU/mL灌胃剂量下致死全部试验小鼠,其中福氏志贺菌SWUN553对BALB/c小鼠灌胃的LD_(50)为1.04×10~6 CFU。福氏志贺菌SWUN553致死小鼠的组织病理学显示试验小鼠心、肝、脾、肺、结肠出现明显的坏死与炎性细胞浸润等病变,回肠的粘膜下层有轻微的炎性细胞浸润,肠道中结肠病变最为严重,提示结肠为该菌入侵的最可能部位。
【学位授予单位】：西南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.61
【图文】：

病原菌,奇异变形杆菌,志贺菌,沙门菌

图 2-1 四种病原菌单一 PCR 特异性扩增结果Fig.2-1 The specific amplification for 4 pathogenic brke DL2000；1：奇异变形杆菌单一 PCR；2：沙门菌单大肠杆菌单一 PCR；4：志贺菌单一 PCR；N：阴DNAMarker; 1: Single PCR product of proteusmirabilis; ; 3: Single PCR product of E.coli; 4: Single PCR product ocontrol病原菌目的基因扩增的目的条带回收、转化、克沙门菌、奇异变形杆菌、志贺菌目的基因的扩同源性均达 99 %以上，表明 PCR 产物确为各目菌提取阳性质粒模板单一 PCR 扩增产物经 2%琼期产物大小相符。

引物,浓度,多重PCR

多重PCR引物浓度优化结果

退火温度,引物,浓度,多重

最佳退火温度（图 2-3）。图 2-2 多重 PCR 引物浓度优化结果Fig.2-2 Optimization results for the primers concentrations ofthe qA Marke DL2000；1～9：K99 最佳引物浓度 500 nmol/L ipaH，度为(500,450,400,350,300,250,200,150,100 nmol/L)；N：阴000 DNA Marker; 1～9: K99 concentration of primer 500 nmol/L,intration of primer(500,450,400,350,300,250,200,150,100 nmol/L)；

【参考文献】