PRV变异株GZDZ2016的分离鉴定与TK基因缺失转移载体的构建

发布时间：2020-07-18 06:13

【摘要】：伪狂犬病病毒为双股DNA病毒,隶属于疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科,全长约150 kb,GC含量高达73%。猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒引起的以神经症状、繁殖障碍为主要特征的严重危害我国养猪业的持续健康发展的疾病,在我国各省规模化猪场普遍存在。据童武2013年报道,自2011年以来中国各省先后发生PR疫病,且免疫PRV疫苗的猪场仍发生,发病率和死亡率明显上升,毒株分离鉴定结果显示,引起该病大规模爆发的病原为变异的猪伪狂犬病毒。贵州省部分已免疫PRV Bartha-K61疫苗株的猪场,也发生类似的PR疫病。2016年贵州省丹寨县某规模化种猪场,在已免疫PRV Bartha-K61疫苗的情况下,部分种猪先后发生流产、产死胎和木乃伊胎,后经实验室诊断确诊为感染PRV野毒所致。为了解该病例中PRV毒株的情况,本研究应用Vero细胞对其进行了分离和鉴定,证实该分离毒株系一株PRV变异毒株(GZDZ2016),并基于该毒株基因序列构建了TK基因缺失转移载体,为PRV变异株TK基因缺失疫苗的研究奠定了基础。1.PRV变异株GZDZ2016的分离鉴定本研究取2016年丹寨县某猪场送检的经实验室确诊为PRV阳性的流产胎儿组织样品,经系列处理后接种于Vero细胞进行传代分离,并应用电镜技术对分离的PRV进行形态学观察,对病毒效价、一步生长曲线及部分基因序列等进行了测定。分离鉴定结果显示,当盲传至第5代时开始产生CPE,至第7代时呈现稳定的CPE,表现为细胞变圆、脱落、呈拉网状等典型CPE;透射电镜下可见位于囊泡中呈近似圆形的成熟病毒粒子,在胞核中可见衣壳呈晶格状排列的病毒包涵体以及空心、实心2种无囊膜的病毒粒子;分离的病毒在Vero细胞上的生长滴度为10~(-8.12)/0.1mL,一步生长曲线显示该病毒滴度在12 h内处于潜伏期,从12 h以后到56 h之间呈增长趋势,至60 h滴度达最大;将分离毒株接种家兔,2天后出现奇痒、亢奋的症状,3天后死亡;后取保存备用的第11代细胞培养液进行gD部分基因的扩增,并对测序结果进行分析,PCR扩增产物经测序证明系PRV gD基因的部分序列。结果表明,成功分离获得了1株猪伪狂犬病病毒贵州株,命名为PRV GZDZ2016株。本试验通过设计合成特异性引物,通过PCR方法扩增了分离株的gB、gC、gD、gE和TK基因,预期大小分别为:2784bp、1651 bp、1273 bp、、1752 bp、1535 bp,并对gC、gD、gE和TK基因进行克隆测序,将测序结果与国内外毒株基因序列进行比对和序列相似性分析,用推导的氨基酸序列绘制系统发育进化树。序列相似性分析结果表明:该分离株主要基因与变异株相似性较高,而与国外毒株相似性较低。序列比对结果显示,该分离株gB、gC、gE和TK蛋白分别有不同数量的氨基酸的变异,gE蛋白第48位和496位均有天冬氨酸(D)的插入,第236位由亮氨酸(L)变为脯氨酸(P);TK蛋白第6位由异亮氨酸(I)变为丙氨酸(A),第157位由天冬氨酸(D)变为甘氨酸(G);gC蛋白第81位由组氨酸(V)变为丙氨酸(A);gB蛋白与国外毒株在第55、70、72~73等位存在明显的氨基酸差异;gD蛋白与2012年后分离的HeN1、TJ、JS2012株等变异毒株未存在氨基酸差异。遗传进化分析结果显示,该分离株与国内近年来分离的变异毒株亲缘关系较近,而与国内外分离的经典毒株亲缘关系较远。以上结果均表明,该分离株属于国内近几年流行的变异毒株,命名为PRV变异株GZDZ2016。2.PRV变异株GZDZ2016 TK基因缺失转移载体的构建设计特异性引物分别扩增PRV变异株GZDZ2016 TK基因上下游同源臂TKL、TKR,大小分别为1066 bp、906 bp。设计特异性引物从pCMV-beta质粒中扩增出报告基因LacZ,大小为4062 bp。将pMD19T-TKR质粒经HindⅢ、EcoRⅠ双酶切后,亚克隆至pcDNA3.1真核表达载体,构建pcDNA3.1-TKR质粒,其大小为6334 bp。之后,再将pMD19T-TKL质粒经NheⅠ-HindⅢ双酶切后,亚克隆至pcDNA3.1-TKR质粒载体中,构建pcDNA3.1-TKL-TKR质粒,其大小为7400 bp。最后,将报告基因LacZ的扩增产物,通过HindⅢ酶切后,克隆至pcDNA3.1-TKL-TKR质粒载体中,构建pcDNA3.1-TKL-LacZ-TKR质粒,该质粒测序鉴定结果表明大小为11462 bp,与预期结果相符。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65
【图文】：

粒子结构

图 1-1 PRV 粒子结构图Fig.1-1 Structure of PRV virion (Pomeranz et al., 2005) 基因组结构基因组为双股线状 DNA（图 1-2），大小约 150 kb，GC 含量高达00 多种蛋白质。PRV 由长独特区（UL 区域）、短独特区（US 区重复序列（IRs 区域）、US 区段两侧末端重复序列（TRs 区域）四PRV 基因组含有至少 70 个基因，其中超 35 种基因是病毒复制非RV 的毒力主要由 gD、gE、gI 和 TK 基因协同控制（范伟兴等，20

基因组结构

3图 1-2 PRV 基因组结构（Barbara et al., 2004）Figure 1-2 PRV genome structure1.4 病毒的理化特性和培养特性PRV 是疱疹病毒中抵抗力最高的，其对普通消毒剂不敏感，而对脂溶剂（、乙醚、酒精等）、X 射线、紫外线和甲醛等敏感，呈几何级数灭活，胰蛋和某些酶类也能将其灭活，0.5%～1.0%NaOH 可很快将病毒灭活，但混在猪苗中不能被杀死。此外，pH 能影响 PRV 的活性，其在过酸或过碱的环境下

病毒,细胞,收毒,病毒核酸

A:正常 Vero 细胞；B:接毒 12 h 的 Vero 细胞；C:接毒 24 h 的 Vero 细胞的 Vero；D:接毒 36 h的 Vero 细胞图 2-1 Vero 细胞接种病毒所产生的 CPEFigure 2-1 CPE produced by Vero cell inoculation3.2 病毒核酸鉴定当细胞病变达 70%~80%时收毒，反复冻融三次细胞培养液，提取病毒核酸，用 PRV gD（305 bp）特异性引物进行 PCR 检测，电泳检测扩增出约 305 bp 的特异性条带，PCR 扩增产物经测序证明系 PRV gD 基因的部分序列（图 2-2）。

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