猪病毒性腹泻PCR检测方法建立与流行病学调查

发布时间：2017-03-30 04:05

  本文关键词：猪病毒性腹泻PCR检测方法建立与流行病学调查，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：生猪养殖是我国畜牧产业的重要支柱,但随着我国生猪养殖业的规模化、集约化发展,导致各种疾病频发,其中猪腹泻更是制约我国养猪业发展的主要原因之一,给我养猪业造成了巨大的损失。近年来,我国大部分地区包括贵州省的养猪场发生了不同程度的腹泻。引起猪发生腹泻的原因有很多,包括寄生虫感染、细菌感染、病毒感染及饲养管理等因素,但以病毒感染较为常见,其中的病原主要有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(Po RV)。为此,本文首先建立了针对猪病毒性腹泻主要病原的PCR检测方法,并进行了流行病学调查和病原分子变异分析。具体研究内容如下:1.猪病毒性腹泻病原PCR方法的建立:(1)三重PCR方法的建立:根据Genbank提供的PEDV S基因、TGEV M基因和Po RV VP7基因参考序列,设计三对特异性引物,以克隆的质粒为模板,进行PEDV、TGEV和Po RV三重PCR检测和反应条件的优化。结果:PEDV、TGEV和Po RV三重PCR反应体系最佳退火温度为51℃,PEDV、TGEV和Po RV最适引物浓度分别为0.5μM/L、0.3μM/L和0.3μM/L,最低质粒模板检出量分别为1×102copies/μL、1×100opies/μL、1×103copies/μL;且该方法不能检出猪圆环病毒2型(PCV2)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV);对102份病料进行检测发现,病料中PEDV、TGEV和Po RV的检出率分别为37.25%、1.96%和6.86%。(2)单项LAMP方法的建立:根据Genbank提供的PEDV M基因、TGEV N基因、Po RV VP7基因参考序列,设计6对特异性LAMP引物,以克隆的全基因重组质粒为模板,进行PEDV、TGEV和Po RV LAMP的检测和反应条件的优化。结果:PEDV、TGEV和Po RV单项LAMP方法最佳反应温度分别为60℃、64℃和62℃,最佳反应时间为60min、60min和90min,最佳外引物与内引物浓度比为200 nmol/L:2400 nmol/L、200 nmol/L:2400 nmol/L和200 nmol/L:3200 nmol/L,最佳Mg2+浓度为2.5 mmol/L、1.0mmol/L和2.5mmol/L,最佳d NTP浓度0.8mmol/L、0.6mmol/L和0.6mmol/L,最佳Bst DNA聚合酶浓度为0.16U/μL、0.64U/μL和0.64U/μL,最低检出量为1.0×102copies/μL、1.0×101copies/μL和1.0×102copies/μL,相互间无交叉反应;对12份病料检测发现,PEDV、TGEV和Po RV的LAMP检测与普通PCR方法检测的符合率分别为75%、100%和100%。2.贵州省猪病毒性腹泻流行病学调查:(1)发病情况调查:采用实地考察及问卷调查等方法对贵州省部分规模养猪场进行猪腹泻发病状况调查、临床症状与病理变化观察,结果:2013年~2015年,在调查的13个规模养猪场中,猪腹泻发生率为61.07%(4368/7153),病死率为71.50%(3123/4368);仔猪腹泻主要发生于4~21日龄,发病时间主要在冬春季节;成年猪多表现为隐性感染;仔猪主要表现为水样腹泻,病变主要在胃肠道,组织病变表现为小肠绒毛脱落。(2)病原学调查:采集2013~2015年规模养猪场猪粪便样本221份,采用建立的三重PCR方法进行PEDV、TGEV和Po RV病原核酸检测,结果:PEDV、TGEV和Po RV核酸检出率分别为59.45%(131/221)、0.92%(2/221)和6.91%(15/221),且PEDV与Po RV、PEDV与TGEV的混合感染率分别为5.88%(13/221)和0.90%(2/221),不同猪群中哺乳仔猪PEDV、TGEV及Po RV的阳性率均为最高,分别为60.00%(96/160)、1.25%(2/160)及8.75%(14/160)。另外,PEDV检出率呈逐年下降趋势。(3)血清学调查:收集2013~2015年24个规模养猪场275份血清样本,采用ELISA方法进行PEDV、TGEV和Po RV抗体检测,结果:免疫猪群中PEDV、TGEV和Po RV的血清抗体阳性率分别为43.09%(53/123)、39.02%(48/123)和42.28%(52/123);未免疫猪群中PEDV、TGEV和Po RV的血清抗体阳性率分别为30.92%(47/152),36.18%(55/152)和38.82%(59/152)。3.PEDV与Po RV分子流行病学调查:根据Gen Bank登录的PEDV和Po RV基因序列,设计PEDV M基因、ORF3基因和Po RV VP7基因特异性引物,然后提取仔猪腹泻临床样本RNA,进行目的基因扩增、克隆和测序,利用DNAStar和MEGA5.0软件进行序列分析。结果:(1)成功克隆到14株PEDV的ORF3基因,全长均为675bp,可编码225个AA,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别在95.1%~100%与95.1%~100%之间;与经典毒株CV777的同源性分别在95.9%~97.2%与93.8%~96.4%之间,贵州流行株的ORF3基因核苷酸在第62、160、235、243、274、301、360、450和497位发生点突变,无插入或缺失;系统进化树分析显示,14株流行毒株与CV777株、美国毒株、越南和韩国毒株亲缘关系较近,与疫苗株Attenuated DR13亲缘关系较远。(2)14株PEDV的M基因全长均为681bp,可编码226个AA;核苷酸和氨基酸序列的同源性分别在98.1%~100%与98.2%~100%之间;与经典毒株CV777的同源性分别在97.9%~99.1%与98.7%~99.1%之间,与弱毒株Attenuated DR13同源性分别在97.9%~98.1%与97.8%~98.2%之间,贵州流行株主要在第125、198、213、234、285、348和618位发生点突变;(3)成功克隆到4株Po RV的VP7基因,全长均981bp,可编码326个AA,核苷酸和氨基酸序列的同源性分别在95.5%~99.7%和96.6%~99.7%之间,与国内外参考毒株的同源性分别为71.4%~97.1%和72.1%~99.1%,与G4型参考毒株的同源性分别为87.0%~97.1%和93.3%~99.1%;系统进化树分析显示,4株贵州流行株与G4型毒株处于同一个群,由此推测4株Po RV贵州流行株属于G4型Po RV。结论:1.成功建立了猪病毒性腹泻主要病原PEDV、TGEV和Po RV三重PCR方法及单项LAMP检测方法。2.贵州省规模养猪场猪病毒性腹泻的主要病原为PEDV;主要发生于哺乳仔猪;主要发生在冬春季节,猪病毒性腹泻疫苗的免疫效果较差。3.贵州省PEDV地方流行株与韩国毒株、越南毒株和美国毒株亲缘关系近,与Attenuated DR13、Brl/87亲缘关系远;贵州省Po RV地方流行株主要是G4型。
【关键词】：猪病毒性腹泻 PCR检测方法 流行病学 分子流行病学
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 英文缩略表12-13
• 文献综述13-24
• 第一章 PEDV、TGEV和Po RV PCR检测方法建立24-60
• 1 材料25-26
• 1.1 试验毒株25
• 1.2 临床样本25
• 1.3 主要试剂25
• 1.4 主要仪器25-26
• 2 方法26-35
• 2.1 质粒标准品的制备26-29
• 2.2 PEDV、TGEV和PoRV三重PCR方法的建立29-33
• 2.3 PEDV、TGEV和PoRV单项LAMP方法的建立33-35
• 3 结果35-57
• 3.1 质粒标准品制备结果35-38
• 3.2 PEDV、TGEV和PoRV三重PCR方法建立结果38-46
• 3.3 PEDV、TGEV和PoRV单项LAMP方法建立结果46-57
• 4 讨论57-60
• 4.1 关于猪病毒性腹泻的主要病原57-58
• 4.2 关于PEDV、TGEV和PoRV三重PCR方法58
• 4.3 关于PEDV、TGEV和PoRV单项LAMP方法58-60
• 第二章 贵州省猪病毒性腹泻流行病学调查60-79
• 1 材料61-62
• 1.1 样本收集61
• 1.2 主要试剂61
• 1.3 主要仪器61-62
• 2 方法62-63
• 2.1 发病状况与临床症状调查62
• 2.2 病理变化观察62-63
• 2.3 PEDV、TGEV和PoRV病原学调查63
• 2.4 PEDV、TGEV和PoRV血清学调查63
• 3 结果63-76
• 3.1 发病情况及临床症状调查结果63-66
• 3.2 病理变化观察结果66-69
• 3.3 PEDV、TGEV和PoRV病原学调查结果69-74
• 3.4 PEDV、TGEV和PoRV血清学调查结果74-76
• 4 讨论76-79
• 4.1 关于PEDV、TGEV和PoRV感染情况76-77
• 4.2 关于猪病毒性腹泻疫苗免疫情况77
• 4.3 关于猪病毒性腹泻的流行特点77-79
• 第三章 贵州省PEDV与PoRV分子流行病学调查79-109
• 1 材料80
• 1.1 试验病料80
• 1.2 主要试剂80
• 1.3 主要仪器80
• 2 方法80-86
• 2.1 PEDV ORF3基因分子流行病学调查80-83
• 2.2 PEDV M基因分子流行病学调查83-84
• 2.3 PoRV VP7基因分子流行病学调查84-86
• 3 结果86-107
• 3.1 PEDV ORF3基因分子流行病学调查结果86-94
• 3.2 PEDV M基因分子流行病学调查结果94-101
• 3.3 PoRV VP7基因分子流行病学调查结果101-107
• 4 讨论107-109
• 4.1 关于PEDV ORF3基因特点及变异情况107
• 4.2 关于PEDV M基因特点及变异情况107-108
• 4.3 关于PoRV VP7基因分型及变异分析108-109
• 全文结论109-110
• 参考文献110-115
• 附录一 攻读研究生期间参与发表文章115-116
• 附录二 各种培养基、溶液及试剂的配制116-117
• 致谢117-118

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