基于RNA适配体检测体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP

发布时间：2020-07-23 13:41

【摘要】：旨在建立简单、快速的检测体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP的方法。本研究以含有T7启动子、VC2GEMM-1核糖开关序列或其突变序列VC2/g20a、spinach2和tRNA序列的双链DNA为模板,利用T7RNA聚合酶体外转录体系制备VC2、VC2/g20aRNA适配体。通过检测绿色荧光强度分析RNA适配体对c-di-GMP和cGAMP的结合能力。结果表明,转录得到的RNA经过加热变性、缓慢退火后得到VC2RNA适配体和VC2/g20a RNA适配体,在125mmol·L~(-1 )KCl和30mmol·L~(-1 )MgCl_2溶液中孵育180min的优化结合条件下,VC2适配体与c-di-GMP特异性结合,VC2/g20a适配体与cGAMP特异性结合;c-di-GMP对VC2适配体的半数效应浓度(EC50)为(89±1.7)nmol·L~(-1),cGAMP对VC2/g20a适配体的半数效应浓度为(309±4.5)nmol·L~(-1);VC2和VC2/g20a能够分别检测低至5nmol·L~(-1)和20nmol·L~(-1)的c-di-GMP和cGAMP;并且发现转录的RNA混合物在未纯化的情况下同样能够检测VC0179体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP。这种方法可以简单快速的检测VC0179体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP,并且为研究其他c-di-GMP和cGAMP合成酶活性提供潜在可能。

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本文编号：2767395