FRBI对卵巢及卵母细胞发育的作用和机理研究

发布时间：2020-07-26 21:30

【摘要】：FSH与颗粒细胞表面上的同源受体FSHR结合可以激活腺苷酸环化酶(AC)和磷脂酶C(PLC),从而产生cAMP,IP_3和二酰基甘油(DAG)。这些第二信使通过几种机制进一步导致下游信号级联的激活,cAMP-鸟嘌呤交换因子(cAMP-GEF)反过来又可以激活一些蛋白激酶,如:GTP结合蛋白(RAP1/RAP2/RAS),这些蛋白又可以进一步激活ERK1/2或p38MAPK。这些蛋白激酶通过激活不同的转录因子,使这些因子磷酸化最终导致颗粒细胞内类固醇生成,并促进颗粒细胞增殖或存活。促卵泡激素受体结合抑制剂(Follicle stimulating hormone receptor binding inhibitor,FRBI)是从人和绵羊卵泡液中提取并经过反相高效液相色谱进一步纯化得到的一种8肽化合物,它能颗粒细胞外通过抑制FSH与FSHR的结合作用,使信号传导受到抑制,进而影响颗粒细胞的增殖。目前的研究多数是同时应用FSH和FRBI对动物体进行实验。而单独应用FRBI能否有效抑制FSH的功能及多大剂量效果最佳,尚未见报道。本研究首先将注射FRBI的小鼠分为M-20、M-30和M-40三个组,分别肌肉注射20、30和40 mg/kg FRBI;阳性对照组(M-FSH组)注射10 IU/只FSH;对照组(M-CG组)注射0.2 mL生理盐水,每组连续注射5d。称量每只小鼠双侧卵巢的重量,HE染色法制作组织切片测定卵巢组织切片中皮质厚度(OCT)和次级卵泡形态大小;ELISA法测定血清FSH和E_2浓度,RT-PCR检测FSHR和ERα的表达,Western Blot检测卵巢FSHR和ERα表达。其次,在5%CO_2浓度、饱和湿度条件下观察卵母细胞在36~39℃六个不同温度在22~30h出现第一极体的数量;根据上述条件将卵母细胞培养于0、5、10、15、20IU/mL FSH和10、20、30、40μg/mL FRBI的培养基中,观察卵母细胞出现极体第一极体的数量。最后,将绵羊卵丘卵母细胞复合体(COC)随机分为五个实验组(O-CG组、O-10组、O-20组、O-30组、O-40组)和一个阳性对照组(O-FSH组);实验组培养基中分别添加0、10、20、30和40μg/mL FRBI,阳性对照组的培养基中添加10IU/mL FSH,卵母细胞成熟后收集细胞培养液用于ELISA方法检测培养液中cAMP、IP3信号通路的变化;用Western Blot检测卵母细胞中FSHR、ERβ和PKA蛋白的表达水平;RT-PCR检测卵母细胞中FSHR、ERβ基因表达。研究结果表明,FSH治疗可以增加次级卵泡和成熟卵泡的数量,增加卵泡发育;而FRBI的治疗会降低次级卵泡和成熟卵泡的数量,并抑制小鼠的卵泡发育。此外,FRBI降低血清FSH和E2浓度,下调卵巢FSHR和ERα蛋白表达和mRNA表达水平。绵羊卵母细胞在10IU/mL FSH及38.5℃条件下培养26h成熟率最高;随着FRBI浓度升高,卵母细胞在38.5℃条件下培养26h,第一极体数量逐渐减少。FRBI能够降低绵羊卵母细胞上FSHR、ERβ基因和FSHR、ERβ及PKA蛋白表达水平。
【学位授予单位】：西北民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.2
【图文】：

图 2-1 第 20d 卵巢和卵泡的组织学观察(×100，比例尺=10μm)。A:M-CG 组; B:M-FSH 组;C:M-20 组; D:M-30 组; E:M-40 组。Fig.2-1 Histological observation of ovaries and follicles on day 20 (×100, scale bar =10 m).A:M-Control group (M-CG); B:M-FSH group; C:M-20group;D:M-30group;EM-40group.2.2 小鼠皮质厚度(OCT)为了研究 FRBI 治疗卵巢发育的影响，分别检测卵巢重量和卵巢皮质厚度。与M-CG组相比, 三个注射FRBI 的小鼠组卵巢重量与FSH 治疗组相比呈剂量依赖性(数据省略)，但是各组之间没有显著的差异性。 本研究结果与 KALLA 研究结果一致[77]。如图 2-2 所示，随着日龄的增加，各组小鼠 OCT 逐渐增大。与 M-CG 相比，M-FSH 组的 OCT 略有增加。与 M-CG 和 M-FSH 组相比，三个注射 FRBI 的小鼠组的 OCT 降低，其中 M-40 组的最小值。第 30 天，M-40 组的 OCT 与 M-FSH组相比显著性的降低(#P <0.05)。结果表明，高剂量的 FBRI(40mg/kg)可以减少小鼠卵巢的皮质厚度。

和卵泡的组织学观察(×100，比例尺=10μm)。AC:M-20 组; D:M-30 组; E:M-40 组。ical observation of ovaries and follicles on day 20 (×roup (M-CG); B:M-FSH group; C:M-20group;D:M-3度(OCT)RBI 治疗卵巢发育的影响，分别检测卵巢重, 三个注射FRBI 的小鼠组卵巢重量与FSH，但是各组之间没有显著的差异性。 本研究示，随着日龄的增加，各组小鼠 OCT 逐渐增T 略有增加。与 M-CG 和 M-FSH 组相比，，其中 M-40 组的最小值。第 30 天，M-40降低(#P <0.05)。结果表明，高剂量的 FBRI度。

#与 M-FSH 组相比，#P <0.05图 2-3 次级卵泡的 MLD 和 MTDFig.2-3 MLD and MTD of secondary follicles2.5 血清 FSH 和 E2浓度如表 2-5 所示，在实验期间五组小鼠的血清 FSH 浓度都随着日龄增加而逐渐增加。从第 15天开始，M-FSH 组小鼠的血清 FSH 浓度高于 M-CG 组(*P <0.05与 M-CG 组和 M-FSH 组相比，M-20 组，M-30 组和 M-40 组的小鼠的血清 FS浓度降低。在第 20d 和第 30d，M-FSH 组小鼠的血清 FSH 浓度高于 M-20，差异显著(#P <0.05)；FSH 组小鼠的血清 FSH 浓度与 M-30 组和 M-40 组比较，差异极显著(##P <0.01)。研究结果表明，FRBI 能够降低血清 FSH 浓度。表 2-5 FSH 血清浓度(ng/mL)Table2-5 Serum FSH concentrations (ng/mL)Group 0d 7d 10d 15d 20d 30dM-CG 9.74±1.31 12.24±1.14 15.76±1.68 18.67±1.71 22.56±2.23 26.88±2.4M-FSH 9.54±1.21 15.44±1.24 21.12±1.88 30.35±3.72 39.88±4.56 45.78±5.7M-20 9.82±1.01 11.68±1.19 19.12±1.79 18.6±1.91 21.27±2.32#30.02±3.4## ##

【参考文献】

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7 吴井生;王金玉;;FSHR基因第10外显子多态性及其与小梅山猪产仔数的相关性[J];中国农业科学;2012年13期

8 谢光斌;朱磊磊;王勇;;卵泡膜细胞与卵巢功能的调控[J];国际妇产科学杂志;2012年01期

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4 牛金涛;水牛FSHR基因与其表达检测的研究[D];广西大学;2007年

本文编号：2771314