滑液支原体二氢硫辛酸脱氢酶的生物学功能研究
发布时间：2020-07-28 11:48
【摘要】：滑液支原体(Mycoplasma synoviae,MS)属于柔膜体纲支原体属,主要感染鸡和火鸡,能导致家禽关节肿大、滑液囊及腱鞘发炎和实质器官的肿大,在国内外感染严重。目前普遍认为MS感染机体后,能以各种方式黏附于宿主上皮细胞。许多支原体中与代谢相关的酶类已经被发现不仅分布于细胞质中发挥生物催化功能,同时分布于细胞膜表面,参与黏附宿主细胞,发挥致病作用。二氢硫辛酸脱氢酶(Dihydrolipoamidedehydrogenase,DLD)是一种黄素蛋白氧化还原酶,目前关于MS的DLD的相关研究很少,在本实验中对MS的DLD的生物学功能及其黏附特性进行了研究,为进一步探索MS的致病机理提供了分子基础。1.滑液支原体DLD的原核表达及蛋白纯化参照NCBI中GenBank的MS WVU1853菌株的dld基因碱基序列,设计特异性引物,经Overlap PCR对基因进行点突变后,将获得的突变后序列克隆至平末端载体pLB,经测序验证成功后连接表达载体pET-28a(+),IPTG诱导表达后原核表达显示重组MSDLD(rMSDLD)表达在上清,用His-tag蛋白纯化磁珠对表达在上清中的rMSDLD进行纯化,得到纯化的rMSDLD蛋白。2.滑液支原体DLD的酶促动力学反应的测定因二氢硫辛酸脱氢酶是一种代谢酶,能将硫辛酰胺催化生成二氢硫辛酰胺,NADH失去H+生成NAD+,用酶标仪连续监测底物NADH的量来显示rMSDLD的酶促活性。结果显示DLD具有一定的酶活性,其比活力为3.6 U/mg,最适pH为7.0、最适反应温度为250C,双倒数作图法求出其公式为y=4.55x+0.1956(R2=0.9973),并求得rMSDLD的米氏常数Km(NADH)为23.2 μmol/L,最大反应速率Vmax为5.1 μmol/(L·min)。3.滑液支原体DLD的免疫原性、亚细胞定位检测利用MS鸡阳性血清作为一抗进行Western-blot检测该蛋白的免疫原性。利用rMSDLD蛋白制备鼠多克隆抗体和兔多克隆抗体,并用ELISA法检测其效价。然后用试剂盒提取MS膜蛋白和胞浆蛋白,利用制备的抗rMSDLD鼠血清作为一抗进行Western-blot反应检测其亚细胞定位情况,同时进行悬浮免疫荧光实验来确证rMSDLD蛋白是否分布于MS膜表面。接下来进行动物实验,对蛋白的免疫保护性进行了评价,同时进行血清介导的补体杀菌实验。免疫原性检测结果发现鸡阳性血清能够别到0.1μg的rMSDLD蛋白,并且条带的亮度与蛋白使用剂量呈正相关,证明蛋白具有较好的免疫原性。制备的鼠多克隆抗体、兔多克隆抗体利用ELISA法检测到其血清效价达到2048000、1024000。用制备的鼠抗rMSDLD血清检测该蛋白在MS中的亚细胞定位情况,发现该蛋白主要存在于MS的胞浆蛋白中,少量分布于MS膜组分中;悬浮免疫荧光证实该蛋白存在于MS膜表面。然后制备rMSDLD蛋白疫苗免疫SPF鸡,MS攻毒后发现rMSDLD蛋白免疫能显著降低鸡只发病程度,具有一定的免疫保护力。抗rMSDLD血清介导的补体杀菌效力达到88.50%,与支原体结合后能够有效激活补体,进而表现出良好的杀菌效果。4.滑液支原体DLD的粘附特性研究利用间接免疫荧光和ELISA实验检测rMSDLD与鸡成纤维细胞DF-1的黏附反应,同时检测抗rMSDLD兔血清对其黏附的抑制作用,结果发现rMSDLD能特异性的黏附到DF-1细胞上,且黏附能被抗rMSDLD兔血清显著性抑制。然后利用Western-blot法和ELISA法检测该蛋白与胞外基质蛋白鸡纤溶酶原(Chickenplasminogen,cPlg)的黏附反应,结果发现rMSDLD蛋白与胞外基质蛋白cPlg黏附明显。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.62
【图文】：
通过ＮＣＢＩ数据库找到ＭＳｔ／Ｗ基因碱基序列，然后通过ＳｉｇｎａｌＰ４．１邋Ｓｅｒｖｅｒ预测出逡逑基因中无信号肽片段，Ｐｒｉｍｅｄ．Ｏ软件分析该序列中含有四个碱基需要突变，因此利用该软逡逑件设计５对特异性引物，经过ＰＣＲ扩增，获得４个ＭＳ观基因分片段（图１．２），再用Ｏｖｅｒｌａｐ逡逑ＰＣＲ的方法将ＴＧＡ突变为ＴＧＧ获得基因全长（图１．３），将ＰＣＲ扩增产物进行琼脂逡逑糖凝胶电泳，并进行胶回收。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋１２逦３逦４逡逑－１逡逑１０００邋＾——？邋１００７邋ｂｐ逡逑７５０逡逑５００邋＾￣￣？邋５８４邋ｂｐ逡逑２５０邋＾逦？逦１邋ｂｐ逡逑１００逦邋？逦１４４邋ｈｐ逡逑图１．２邋ＭＳｏＷ基因的ＰＣＲ分段产物逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆＭＳｄｌｄ邋ｇｅｎｅ逡逑Ｍ：邋２０００ＤＮＡ邋分子质量标准；１：邋ＭＳｃ／ＷｌＦ／ｌＲ邋扩增产物；２：邋ＭＳｏＷ２Ｆ／２Ｒ邋扩增产物；３：邋ＭＳｃ／Ｗ３Ｆ／３Ｒ逡逑扩X棽铮唬矗哄澹停樱颍妫祝矗疲矗依┰霾铮诲义希停哄澹模蹋玻埃埃板澹模危铃澹停幔颍耄澹颍诲澹保哄澹校茫义澹穑颍铮洌酰悖翦澹鳎椋簦桢澹穑颍椋恚澹颍箦澹铮妫停樱洌
本文编号：2772836
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.62
【图文】：
通过ＮＣＢＩ数据库找到ＭＳｔ／Ｗ基因碱基序列，然后通过ＳｉｇｎａｌＰ４．１邋Ｓｅｒｖｅｒ预测出逡逑基因中无信号肽片段，Ｐｒｉｍｅｄ．Ｏ软件分析该序列中含有四个碱基需要突变，因此利用该软逡逑件设计５对特异性引物，经过ＰＣＲ扩增，获得４个ＭＳ观基因分片段（图１．２），再用Ｏｖｅｒｌａｐ逡逑ＰＣＲ的方法将ＴＧＡ突变为ＴＧＧ获得基因全长（图１．３），将ＰＣＲ扩增产物进行琼脂逡逑糖凝胶电泳，并进行胶回收。逡逑ｂｐ邋Ｍ邋１２逦３逦４逡逑－１逡逑１０００邋＾——？邋１００７邋ｂｐ逡逑７５０逡逑５００邋＾￣￣？邋５８４邋ｂｐ逡逑２５０邋＾逦？逦１邋ｂｐ逡逑１００逦邋？逦１４４邋ｈｐ逡逑图１．２邋ＭＳｏＷ基因的ＰＣＲ分段产物逡逑Ｆｉｇ．邋１．２邋Ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆＭＳｄｌｄ邋ｇｅｎｅ逡逑Ｍ：邋２０００ＤＮＡ邋分子质量标准；１：邋ＭＳｃ／ＷｌＦ／ｌＲ邋扩增产物；２：邋ＭＳｏＷ２Ｆ／２Ｒ邋扩增产物；３：邋ＭＳｃ／Ｗ３Ｆ／３Ｒ逡逑扩X棽铮唬矗哄澹停樱颍妫祝矗疲矗依┰霾铮诲义希停哄澹模蹋玻埃埃板澹模危铃澹停幔颍耄澹颍诲澹保哄澹校茫义澹穑颍铮洌酰悖翦澹鳎椋簦桢澹穑颍椋恚澹颍箦澹铮妫停樱洌
本文编号：2772836
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