猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体快速检测方法
发布时间：2020-07-30 15:43
【摘要】：伪狂犬病是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的多动物共患病,猪是伪狂犬病毒的天然宿主。2011年底,我国多省份经gE基因缺失株Bartha-K61弱毒疫苗免疫的猪突发伪狂犬疫病,对猪场造成巨大经济损失。病毒分离等实验证明疫病爆发根源是该毒株发生变异。对感染PRV变异株和疫苗免疫的猪区别诊断,是国际上控制伪狂犬病的策略之一。为有效防控并清除猪伪狂犬病,亟需建立针对PRV变异株gE蛋白抗体的检测方法。本实验用原核系统表达了PRV新流行株河南博爱株的gE蛋白,建立了一系列检测gE蛋白抗体的方法。建立了间接ELISA方法,包被抗原浓度0.32μg/mL,待检血清1:400稀释,1%牛血清白蛋白(BSA)封闭,羊抗猪IgG 5 000倍稀释,以5倍信噪比为阴阳性判定标准。本方法与阻断法ELISA试剂盒相比符合率为91.36%,灵敏性为76.92%,特异性为94.12%。为建立更快速的检测方法,基于间接ELISA实验,我们将gE蛋白与猪IgG分别作为检测线和质控线,以胶体金颗粒标记羊抗猪IgG制备免疫胶体金,组装成胶体金免疫层析试纸条。试纸条的质控线(C线)包被2 mg/mL的猪IgG,检测线(T线)包被2 mg/mL的gE蛋白。胶体金标羊抗猪IgG的pH 9.0~9.2,浓度0.07 mg/mL。敏感性实验发现,血清稀释640倍时检测线和质控线最清晰,但特异性实验发现试纸条特异性较差。为更快速准确地检测gE蛋白抗体,我们建立了基于磁珠的检测方法。优化反应条件后,本方法检测限达到阳性血清稀释51 200倍,线性范围为血清稀释50~25 600倍,灵敏度比ELISA方法有较大提高。并且,本方法可在30 min内完成gE蛋白抗体检测。综上所述,本实验建立了三种检测PRV gE蛋白抗体的方法:间接ELISA方法、免疫层析试纸条方法以及基于磁珠的快速检测方法。基于磁珠的快速检测具有灵敏度高、操作简便等优点,有望开发成新型PRV gE蛋白抗体快速检测商品化试剂盒。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4
【图文】：
图 1-1 猪伪狂犬病毒粒子(Pomeranz et al 2005)Fig.1-1 The PRV virion伪狂犬病流行病学980s 以后猪伪狂犬病在世界范围内爆发，近三十年来国内外联合伪疫苗的使用和疫苗株和野毒株的区别诊断，并通过一系列清除计划犬病有了较好的控制。在 2007 年 6 月，美国宣称净化根除了 PRV如荷兰、奥地利、德国等也展开 PRV 净化根除计划(Morrison 1991)由卡介苗创始人刘永存首次分离得到伪狂犬病毒，目前为止已经有狂犬病的爆发，地方性规模化猪场有比较严重的 PR 野毒感染情况，临着较大压力(伏彭 2016)。2011 年后由伪狂犬爆发的变异株引起的在ha-K61 的猪场爆发了伪狂犬病造成巨大经济损失(Yuan et al 2016)。，经典的进口疫苗匈牙利株 Bartha-K61 不能在对 PRV 感染形成有l 2018)。针对 2011 年底爆发的变异株，我国自主研发的疫苗已经有
图 1-2 免疫层析试纸示意图Fig. 1-2 Schematic diagram of the immunochromatograp析技术的横向免疫层析横向免疫层析试纸条(LFICS)是一种可以直接通过肉眼观察用以干燥形式存储的试剂制备的试纸传感器，具有检测快速、点，是当前即时检测的强大工具。目前，各种 LFICS 产品开生物医学中的生物标志物，如蛋白质、药物和激素，食品安污染物，如生物毒素和病原体。传统的免疫层析试纸条一般灵敏度和检测线不足，如图 1-3 所示随着纳米技术的发展现析试纸条，这些类型包括有色纳米颗粒(例如金纳米颗粒 GNs 和胶体硒纳米粒子 SNPs)、发光纳米颗粒(例如量子点 QDs、
图 1-3 基于纳米颗粒的 LFICS 检测策略的示意图Fig1-3. Schematic illustration for LFICS detection strategies based on NPs1.2.3.2 胶体金免疫层析免疫胶体金层析技术是建立在胶体金技术、层析技术、免疫检测技术结合起来的一种快速、高效、灵敏的即时检测技术。胶体金免疫层析试纸条一般是以蛋白吸附较好的膜材料比如尼龙膜和硝酸纤维素(NC)或者聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜作为载体。其中最常用的是硝酸纤维素膜，相比较其他膜材料 NC 膜对蛋白具有较高的非特异性力(Kreplak et al 2007)并且在使用前无需处理，有良好的亲水性，广泛应用于微流体技术、免疫分析和生化分析(Gao et al 2014)。胶体金免疫层析试纸条的原理是基于酶联免疫吸附试验原理，但由于吸附材料及组成不同，胶体金测抗原或抗体原理较 ELISA 情况更复杂，需要综合考虑胶体金标记抗体示踪以及检测线和质控线上包被抗体蛋白的组合。对于病毒抗原的检测一
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.4
【图文】：
图 1-1 猪伪狂犬病毒粒子(Pomeranz et al 2005)Fig.1-1 The PRV virion伪狂犬病流行病学980s 以后猪伪狂犬病在世界范围内爆发，近三十年来国内外联合伪疫苗的使用和疫苗株和野毒株的区别诊断，并通过一系列清除计划犬病有了较好的控制。在 2007 年 6 月，美国宣称净化根除了 PRV如荷兰、奥地利、德国等也展开 PRV 净化根除计划(Morrison 1991)由卡介苗创始人刘永存首次分离得到伪狂犬病毒，目前为止已经有狂犬病的爆发，地方性规模化猪场有比较严重的 PR 野毒感染情况，临着较大压力(伏彭 2016)。2011 年后由伪狂犬爆发的变异株引起的在ha-K61 的猪场爆发了伪狂犬病造成巨大经济损失(Yuan et al 2016)。，经典的进口疫苗匈牙利株 Bartha-K61 不能在对 PRV 感染形成有l 2018)。针对 2011 年底爆发的变异株，我国自主研发的疫苗已经有
图 1-2 免疫层析试纸示意图Fig. 1-2 Schematic diagram of the immunochromatograp析技术的横向免疫层析横向免疫层析试纸条(LFICS)是一种可以直接通过肉眼观察用以干燥形式存储的试剂制备的试纸传感器，具有检测快速、点，是当前即时检测的强大工具。目前，各种 LFICS 产品开生物医学中的生物标志物，如蛋白质、药物和激素，食品安污染物，如生物毒素和病原体。传统的免疫层析试纸条一般灵敏度和检测线不足，如图 1-3 所示随着纳米技术的发展现析试纸条，这些类型包括有色纳米颗粒(例如金纳米颗粒 GNs 和胶体硒纳米粒子 SNPs)、发光纳米颗粒(例如量子点 QDs、
图 1-3 基于纳米颗粒的 LFICS 检测策略的示意图Fig1-3. Schematic illustration for LFICS detection strategies based on NPs1.2.3.2 胶体金免疫层析免疫胶体金层析技术是建立在胶体金技术、层析技术、免疫检测技术结合起来的一种快速、高效、灵敏的即时检测技术。胶体金免疫层析试纸条一般是以蛋白吸附较好的膜材料比如尼龙膜和硝酸纤维素(NC)或者聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜作为载体。其中最常用的是硝酸纤维素膜，相比较其他膜材料 NC 膜对蛋白具有较高的非特异性力(Kreplak et al 2007)并且在使用前无需处理，有良好的亲水性，广泛应用于微流体技术、免疫分析和生化分析(Gao et al 2014)。胶体金免疫层析试纸条的原理是基于酶联免疫吸附试验原理，但由于吸附材料及组成不同，胶体金测抗原或抗体原理较 ELISA 情况更复杂，需要综合考虑胶体金标记抗体示踪以及检测线和质控线上包被抗体蛋白的组合。对于病毒抗原的检测一
【参考文献】
相关期刊论文 前7条
1 何启盖;童光志;杨汉春;张桂红;姜平;张永光;张改平;伍少钦;章洪皲;;猪伪狂犬病流行病学特征、净化技术及其应用示范[J];中国畜牧杂志;2015年24期
2 张文通;魏凤;王金良;肖跃强;沈志强;;猪圆环病毒2型胶体金抗体检测方法的建立[J];中国预防兽医学报;2012年09期
3 张利勃;周铁忠;王s
本文编号：2775751
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