禽圆环病毒2型分子生物学特性及基因功能研究

发布时间：2020-07-31 09:12

【摘要】：禽圆环病毒2型(AGV2)是在2011被报道发现的指环病毒属的第二个成员,于2015年首次在我国被检测报道。AGV2不仅仅感染禽类,而且还有若干关于AGV2在健康人类、器官移植病人和艾滋病病毒(HIV)阳性病人血液中的检测报道。而对于该病毒的其他方面我们却知之甚少。AGV2在全球范围内的传播和感染,使其对养禽业和公共卫生安全都表现出了巨大的潜在威胁。本研究组在2015年4月到2016年4月间,进行了覆盖中国大部分地区养禽业中AGV2的流行病学调查。在来自15个不同的省(市)的总计448份禽类病料(2015年282份,2016年166份)中,共检测到了 55个阳性结果,其中2015年有45个,2016年有10个,总阳性率为12.28%,这些阳性结果分布在11个省(市)中。在阳性结果中,只有10个(18.19%)是单独感染,其余的(81.82%)都为混合感染。对AGV2阳性结果的地理和时间分布的分析显示,85.45%的阳性病料收集自我国的北方,并且在秋天获得了更多的阳性病料。此外,我们检测了我国北方在售的商用禽类疫苗中AGV2基因组的混入情况。结果显示,来自11个不同生产商的23个疫苗为AGV2阳性,阳性比例为27.71%,而在所有23个阳性结果中,有17个疫苗(73.91%)为NDV和IBV相关疫苗。部分序列的测序结果显示,多株AGV2毒株混入在疫苗中。本研究的结果对疫苗的安全性提出了挑战,同时也提高了 AGV2的威胁性。利用三段部分重叠的PCR测序结果进行AGV2全基因组序列的拼接,然后参考GenBank中的所有已知核酸序列分析了不同宿主来源AGV2的遗传进化关系,又进一步分析了不同进化分枝中病毒蛋白的特点,比较了中国毒株和国外毒株病毒蛋白的变化趋势。实验中,从2015年至2016年国内不同地区的病料中一共获得了 17株禽源AGV2全基因组序列,经序列分析比对,所有不同宿主来源的AGV2被分成了 A-D四个组;在VP1的第288-314位氨基酸发现疑似高变区;找到了 VP2与VP3不同分组的氨基酸变化规律;在AGV2的5'-UTR发现了3个重复序列的新基序,并对DR区进行了分类和统计分析。根据AGV2的保守序列建立了对于AGV2有高灵敏性的荧光定量PCR检测方法。此方法的灵敏度为100个病毒基因组拷贝,是常规PCR灵敏度的10倍;此方法重复性良好,组内和组间检测的变异系数都小于1%。利用其高灵敏性,从临床病料中检测到了更多的阳性结果,其中15/82(17.24%)个鸡源和8/29(27.58%)人源AGV2阳性结果,与常规PCR的结果(12.20%和18.29%)有显著的差异(P0.01)。应用此定量方法,我们研究了 AGV2在临床感染鸡只中不同器官和组织的病毒载量。结果显示,AGV2在鸡体内有广泛的分布;在肺脏和血液中有很高的病毒载量。通过1日龄SPF鸡的体内实验,对AGV2进行了病毒分离,并通过PCR与负染色电镜对AGV2进行了鉴定。而后,初步探索了 AGV2的致病性。选取垂直传播感染非致病性CAV的1日龄雏鸡,通过肌肉注射感染AGV2HLJ1508毒株。结果显示,混合感染造成了 56.67%的致死率,并伴随严重的出血-再生障碍性贫血症。混合感染引起了显著的肝脾肿大,胸腺萎缩,明显的腺胃出血和骨髓黄化。除此之外,血常规检测也证明了混合感染造成的贫血症和免疫抑制。对AGV2的基因功能进行了研究,包括5'-UTR与病毒蛋白两部分。其一,找到了 AGV2的启动子序列,并通过一系列双荧光报告系统证明了其起始转录的功能,此外,证明了 5'-UTR中DR区有着增强子的功能。更有趣的是,在蛋白水平和核酸水平证实了不同DR组合的转录能力存在着差异,这可能是影响AGV2分离株致病性的原因之一。其二,探索了 AGV2 VP2和VP3在癌症细胞中的功能。首先,这两个病毒蛋白有着相似的亚细胞定位,都定位于Hela细胞的细胞核中。通过流式细胞术检测到这两种病毒蛋白可以诱导约50%的Hela细胞发生凋亡,但它们引起线粒体释放细胞色素C的能力却不同,提示此两种蛋白诱导凋亡的通路可能不同。此外,这两种蛋白都可以上调DNA损伤标志分子γH2AX的表达量,而同时上调表达的Chk2暗示此两种蛋白可能涉及ATM-Chk2细胞周期信号通路。在本研究中获得的结果建立了对AGV2分子生物学特性和基因功能的初步认识,为进一步揭开AGV2和指环病毒生物学特性的神秘面纱提供了丰富的研究材料。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.65
【图文】：

模式图,模式图,双荧光,启动子

２．７禽圆环病毒２型５ＭＪＴＲ的功能研究逡逑２．７．１双焚光报告基因的构建方案逡逑根据ＡＧＶ２基因组的结构模式图，图２－１，为研究ＡＧＶ２的５＇－ＵＴＲ以及ＤＲ区的功逡逑能，设计了如下的实验方案。在ＡＧＶ２的编码区上游，－３３邋ｂｐ位置有一个ＴＡＴＡ邋ｂｏｘ，逡逑（丁人丁人八０），而且在－９５邋６？位置存在一个匚八人丁１３（？，（０：入八丁）。推测人０￥２的５，－１；丁１１应逡逑该具有启动子的功能，故构建双荧光报告系统验证此功能。逡逑－９５邋ｂｐ逦ＣＡＡＴｂｏｘ邋（ＣＣＡＡＴ）逡逑－３３邋ｂｐ逦ＴＡＴＡ邋ｂｏｘ邋（ＴＡＴＡＡＧ）逡逑图２－１邋ＡＧＶ２基因组的结构模式图逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｔｈｅ邋ｍｏｄｅｌ邋ｐａｔｔｅｒｎ邋ｏｆ邋ＡＧＶ２邋ｇｅｎｏｍｅ逡逑首先，为控制变量，通过序列比对，找到不同ＡＧＶ２５＇－ＵＴＲ中的同源性最高的启动子序逡逑列，并作为双荧光报告质粒的公共部分。逡逑然后，根据３．３．３．５获得的不同ＡＧＶ２邋ＤＲ区的组合特点，除Ａ－Ｆ六种被发现的组合形逡逑式，又人为创造了一个只在第二个元件出现ｂ型ＤＲ的新

模式图,区组,双荧光,启动子

示意图,双荧光,报告基因,示意图

根据示意图２－３的方案，以ｐＣＡＧＧＳ哺乳动物细胞真核表达载体为骨架，分别构逡逑建名为邋Ｇ＋Ｒ，ＧＰＲ邋和邋Ａ－ＤＲ、Ｂ－ＤＲ、Ｃ－ＤＲ、Ｄ－ＤＲ、Ｅ－ＤＲ、Ｆ－ＤＲ邋与邋Ｍ－ＤＲ邋共邋９邋个双荧光报逡逑告质粒。逡逑Ａ－ＤＲ逡逑Ｂ－ＤＲ逦｜逡逑Ｃ－ＤＲ逦｜＿逦邋＾逦＿＿＿＿＿＿逡逑Ｄ－ＤＲ邋一邋ＧＦｐ邋＿一邋．ｉｌＸＤＳＡ＾Ｄｉｉ：邋．１１】遍ｉｉ媝＾１：卿】逡逑Ｅ－ＤＲ逦Ｆ逡逑Ｆ－ＤＲ逡逑Ｍ－ＤＲ」逦｜逡逑ＧＰＲ逦ＧＦＰ逦？邋卿？逡逑Ｇ＋Ｒ逦＾邋ＪＳＦＰ邋二逡逑图２－３构建的双荧光报告基因示意图逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｔｈｅ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｄｕａｌ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｒｅｐｏｒｔｅｒ邋ｇｅｎｅ邋ｓｙｓｔｅｍ逡逑其中，Ｇ＋Ｒ指的是在ＧＦＰ完整ＯＲＦ的终止密码子（ＴＡＡ）后，紧接着加上ＲＦＰ的完整逡逑读码框所构成的报告质粒；ＧＰＲ指的是在质粒Ｇ＋Ｒ的基础上，在ＧＦＰ的终止密码子之后，逡逑在ＲＦＰ的读码框之前，插入公共的启动子序列所构成的报告质粒；Ａ－ＤＲ、Ｂ－ＤＲ等指的是在逡逑质粒ＧＰＲ的基础上，在启动子序列之前，在ＧＦＰ的终止密码子之后，插入Ａ型或Ｂ型等的逡逑ＤＲ组合所构成的报告质粒。逡逑２．７．２融合ＰＣＲ构建重组质粒逡逑首先，分别用引物ｅＧＦＰ－Ｆ、ｅＧＦＰ－Ｒ和引物ｍＲＦＰ－Ｆ、ｍＲＦＰ－Ｒ从质粒ｐＥＧＦＰ－Ｎｌ和逡逑ｐｌｔＬＣ３上扩增出完整的ｅＧＦＰ与ｍＲＦＰ的读码框。再用引物Ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｅＧＦＰ－Ｆ、ｅＧＦＰ－Ｒ和逡逑ｍＲＦＰ－Ｆ、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ－ｍＲＦＰ－Ｒ，以ｅＧＦＰ和ｍＲＦＰ为模板，分别扩增出带有同源臂的ｅＧＦＰ和逡逑ｍＲＦＰ

【参考文献】