HOXC10基因对绵羊骨髓间充质干细胞增殖、凋亡及分化特性的影响
发布时间：2020-08-02 04:08
【摘要】：骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是来源于中胚层的成体干细胞之一,能够分化为成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞等细胞类型,因此,其常作为组织再生的重要的细胞来源之一。然而,目前对BMSCs定向分化分子机制的研究仍然存在疑问,不清楚有哪些因素影响了其分化潜能。最近的研究发现,Homeobox(HOX)基因参与了BMSCs的增殖、凋亡和分化的调节过程。本研究通过分离绵羊BMSCs(sBMSCs)、构建HOXC10的过表达载体及干扰载体,将两种载体利用电转染的方法分别转入sBMSCs中,观察HOXC10对sBMSCs增殖、凋亡的影响。在此基础上分别对sBMSCs进行成脂诱导及成骨诱导,通过油红O染色、脂滴定量检测、茜素红染色、骨钙素定量分析,以及对成脂、成骨相关基因在mRNA及蛋白水平的表达情况检测,研究HOXC10在sBMSCs成脂及成骨分化过程中的功能及其对分化潜能的影响。利用细胞贴壁法分离sBMSCs,通过传代、免疫荧光观察以及细胞诱导检测其干细胞特性,结果表明已成功分离sBMSCs。同时,通过基因片段PCR、连接、酶切等方法成功构建了HOXC10的过表达载体及干扰载体。220V、2.5ms条件下对sBMSCs进行电转染,在电转染48h后进行效率检测,发现HOXC10过表达载体转入sBMSCs后HOXC10表达量较于对照组升高371.68倍,而转染干扰载体的sBMSCs中HOXC10表达量相较于对照组降低了80.38%,表明构建的两个载体为有效载体。电转染后的sBMSCs培养24h、48h、72h后分别加入CCK8(Cell Counting Kit-8),并于450nm处检测吸光度值,发现HOXC10的过表达会促进细胞的生长,HOXC10的干扰会抑制细胞生长。通过流式细胞仪检测HOXC10对于sBMSCs凋亡情况的影响发现:HOXC10过表达会抑制sBMSCs凋亡,而干扰HOXC10则能促进sBMSCs凋亡。分别将转入HOXC10过表达和干扰载体的sBMSCs在成脂诱导3d、6d、12d、18d后通过油红O染色、脂滴定量检测、观察其脂滴形成情况,同时利用qPCR、Western Blot及灰度分析对成脂诱导相关基因LPL、PPARG、Fabp4、ACC的mRNA转录水平及LPL、PPARG的蛋白表达水平进行检测,结果发现HOXC10过表达对于成脂诱导具有促进作用,干扰HOXC10能抑制成脂过程。同时,分别将转入HOXC10过表达和干扰载体的sBMSCs在成骨诱导3d、7d、11d、14d通过茜素红染色、钙结节定量检测观察其钙结节形成情况,并通过qPCR、Western Blot以及灰度分析检测成骨诱导相关基因COLIA1、BMP5、Runx2、OPN的mRNA转录水平及Runx2、OPN的蛋白表达水平,发现HOXC10基因过表达及干扰对于sBMSCs成骨没有明显的作用。本研究结果表明,HOXC10过表达对sBMSCs的增殖起促进作用、对其凋亡起抑制作用,同时能促进成脂。反之,HOXC10干扰则能抑制sBMSCs增殖,促进其凋亡、对成脂起抑制作用。经研究发现HOXC10表达量的变化对sBMSCs成骨没有明显的作用。以上实验研究为今后深入研究HOXC10在BMSCs分化过程中的功能及其对分化潜能的作用机制提供了实验依据。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S826
【图文】：
图 1.1 HOX 基因簇进化情况[10]Figure 1.1 Genesis and evolution of HOX clusters物的同源盒基因共分为两类：一类为成簇排列在染进行表达的 I 类同源盒基因（A-P 型），也被称为 特异性；另一类是与 HOX 基因有高度的序列同一性为散在 Homeobox 基因，研究人员普遍认为这些基多数的基因独立散布在不同染色体上。这些散在 H能，还执行其它功能，其中部分散在 Homeobox 基普遍认为这类 ParaHOX 基因本质上是 HOX 基因在集群。另外，HOX 基因还存在一种亲缘关系更加疏称为 NK 簇。比较基因组学研究表明 NK 簇、HOX 和且具有进化相关性，但三者在胚胎发育过程中的表
图 3.1 原代 sBMSCs 形态（4×）A：第 6 天 sBMSCs 形态 B：第 9 天 sBMSCs 形态Figure 3.1 Morphology of primary sBMSCs (4×)A: Morphology of 6d sBMSCs B: Morphology of 9d sBMSCs 代 sBMSCs 的复苏后形态 3.2 分别为 sBMSCs P2 细胞解冻 4h、24h、48h、72h 的细胞形态。从图上可以 sBMSCs 在解冻 4h 后已经完成贴壁，细胞形态多趋近于圆形。解冻 24h 后可，多为长梭形或长多边形，这是典型的 BMSCs 细胞形态。细胞数随培养时间，由于细胞间接触越来越紧密，细胞形态接近于短梭形，在 72h 细胞汇合度已接传代或下一步实验操作。
图 3.2 P2 sBMSCs 的复苏后形态（4×）A：复苏 4h 后 sBMSCs 形态 B：复苏 24h 后 sBMSCs 形态C：复苏 48h 后 sBMSCs 形态 D：复苏 72h 后 sBMSCs 形态igure 3.2 Morphology of post-recovery P2 generation sBMSCs（4×）logy of sBMSCs after 4h recovery B: Morphology of sBMSCs after 24h rlogy of sBMSCs after 48h recovery D: Morphology of sBMSCs after 72h r荧光鉴定
本文编号：2778140
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S826
【图文】：
图 1.1 HOX 基因簇进化情况[10]Figure 1.1 Genesis and evolution of HOX clusters物的同源盒基因共分为两类：一类为成簇排列在染进行表达的 I 类同源盒基因（A-P 型），也被称为 特异性；另一类是与 HOX 基因有高度的序列同一性为散在 Homeobox 基因，研究人员普遍认为这些基多数的基因独立散布在不同染色体上。这些散在 H能，还执行其它功能，其中部分散在 Homeobox 基普遍认为这类 ParaHOX 基因本质上是 HOX 基因在集群。另外，HOX 基因还存在一种亲缘关系更加疏称为 NK 簇。比较基因组学研究表明 NK 簇、HOX 和且具有进化相关性，但三者在胚胎发育过程中的表
图 3.1 原代 sBMSCs 形态（4×）A：第 6 天 sBMSCs 形态 B：第 9 天 sBMSCs 形态Figure 3.1 Morphology of primary sBMSCs (4×)A: Morphology of 6d sBMSCs B: Morphology of 9d sBMSCs 代 sBMSCs 的复苏后形态 3.2 分别为 sBMSCs P2 细胞解冻 4h、24h、48h、72h 的细胞形态。从图上可以 sBMSCs 在解冻 4h 后已经完成贴壁，细胞形态多趋近于圆形。解冻 24h 后可，多为长梭形或长多边形，这是典型的 BMSCs 细胞形态。细胞数随培养时间，由于细胞间接触越来越紧密，细胞形态接近于短梭形，在 72h 细胞汇合度已接传代或下一步实验操作。
图 3.2 P2 sBMSCs 的复苏后形态（4×）A：复苏 4h 后 sBMSCs 形态 B：复苏 24h 后 sBMSCs 形态C：复苏 48h 后 sBMSCs 形态 D：复苏 72h 后 sBMSCs 形态igure 3.2 Morphology of post-recovery P2 generation sBMSCs（4×）logy of sBMSCs after 4h recovery B: Morphology of sBMSCs after 24h rlogy of sBMSCs after 48h recovery D: Morphology of sBMSCs after 72h r荧光鉴定
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本文编号：2778140
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