猪巨噬细胞感染不同基因型弓形虫后的转录组研究

发布时间：2020-08-02 09:33

【摘要】：刚地弓形虫是人兽共患寄生虫病,可以感染几乎所有的温血动物,通过其分泌蛋白改变宿主细胞的信号通路状态、调节宿主基因的表达量,进而影响宿主的生命活动进程。根据弓形虫感染小鼠的毒力可以分为:I型、II型和III型。近些年来,随着经济的增长,人们生活水平的不断提高,对猪肉的需求大幅上涨,然而猪弓形虫病不仅给养猪业造成了重大的经济损失,同时也造成了我国居民弓形虫感染率的上升。由于目前对弓形虫病防控的基础研究不足,尤其是对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制尚不清楚。因此,国内外许多科研工作者建立动物模型,用于研究对弓形虫与宿主之间相互作用的分子机制。本研究利用RNA-Seq高通量测序研究不同基因型弓形虫对猪巨噬细胞感染后的转录组变化,鉴定出弓形虫感染细胞后的差异表达的基因及免疫途径,发现不同基因型弓形虫在调控型I干扰素和NF-κB信号通路的差异,通过弓形虫感染BALB/c小鼠,利用Real-time PCR检测小鼠脾脏中细胞因子的变化,同时利用Western Blot研究GRA15调控NF-κB信号通路的分子机制,将质粒GRA15电转到RAW264.7细胞,研究其对免疫因子的影响。(1)不同基因型弓形虫的速殖子感染3D4/21细胞后的转录组分析将RH、HB1和ME49弓形虫速殖子感染3D4/21细胞,利用RNA-Seq高通量测序检测6h、12h和24h时间点转录组的变化,发现差异表达基因随着感染时间的延长而增加,Ⅱ型虫株诱导的差异表达基因明显高于Ⅰ型虫株,进行GO富集和KEGG分析,三种弓形虫速殖子在涉及巨噬细胞的免疫或疾病相关途径存在差异。(2)不同基因型弓形虫对小鼠脾脏的免疫因子的影响通过腹腔接种弓形虫Ⅰ型RH、HB1和Ⅱ型Me49感染BALB/c小鼠,根据不同基因型弓形虫的毒力,设置不同的时间间隔来定时收取脾脏组织。利用Real-time PCR技术检测小鼠先天性免疫细胞因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-10和PD-1的相对表达量。结果显示,在RH、HB1急性感染和Me49慢性感染中,IFN-γ和IL-10的表达变化十分明显,且均在感染后期有着很高的表达量。而相对地,PD-1在各基因型弓形虫感染中所诱导的表达量较低,且随时间变化不太明显。(3)GRA15激活NF-κB信号通路的分子机制将GRA15质粒脂质转染到HEK293T细胞,利用Western blot检测细胞中IκB和p-IκB的表达,发现p-IκB的表达水平显著增加,当使用IκB激酶抑制剂MG-132后p-IκB表达水平明显减少。结果说明GRA15有可能是通过降解IκB蛋白来激活NF-κB信号通路。(4)GRA15对RAW 264.7细胞因子的影响使用电穿孔法将GRA15质粒转染到RAW264.7细胞中,分别收集12h和24h的细胞,通过Real-time PCR检测细胞因子的表达水平。实验结果表明,GRA15(-4)可以引起细胞IFN-β表达量的显著上升;GRA15(I)和GRA15(II)则可以激活并诱导细胞分泌IFN-γ;而GRA15(I)、GRA15(II)以及GRA15(-4)对IL-12、TNF-α、i NOS和PD1均无明显影响。本研究首次对猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)感染不同基因型弓形虫后的转录组进行了研究和分析,描述了细胞感染弓形虫后差异基因的表达变化。同时,在不同时间点鉴定的功能性差异表达基因和KEGG通路有助于更好地了解宿主免疫和防御机制,促进对弓形虫感染的预防和控制,了解这些途径提供的信息可能对开发合理设计的弓形虫治疗剂和疫苗至关重要。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S858.28
【图文】：

弓形虫,生活史,速殖子

华中农业大学 2018 届硕士研究生学位论文形虫的传播速度比给小鼠喂卵囊的速度快(Dubey 1997)。接种 1 小时后，在小鼠肠上皮细胞中检测到缓殖子，并在 2 小时内分化为速殖子(Dubey 1997)。48 小时后，能在淋巴结中检测到速殖子。一旦速殖子感染迁移细胞，如巨噬细胞和树突状细胞，它们可以迅速分散到整个宿主中(Ueno et al 2014)。最终，来自免疫系统的压力诱导速殖子转化为慢性感染相关的无性生殖阶段。含有缓殖子的包囊可以在横纹肌和中枢神经系统组织中存活数十年(Dubey et al 1998)。当未感染的猫科动物吞食慢性感染的中间宿主时，弓形虫进入下一个生殖循环。

质粒,致密颗粒,弓形虫,荧光素酶

3.1.2 虫株、菌株和细胞E.coli 菌株 DH5α 由本实验保存；刚地弓形虫 RH、Me49 和 HB1 株速殖子由本实验室液氮保存；人肾上皮细胞 HEK293T 细胞、小鼠巨噬细胞 RAW264.7 和人成纤维细胞HFF 由本实验室液氮保存；Ⅱ型弓形虫致密颗粒蛋白 15 质粒 pCMV-GRA15(Ⅱ)、Ⅰ型弓形虫致密颗粒蛋白 15 质粒 pCMV-GRA15(Ⅰ)、Ⅰ型弓形虫致密颗粒蛋白 15 截短质粒pCMV-GRA15(-4)、NF-κB 启动子荧光素酶报告质粒 pNF-κB 和表达海肾荧光素酶的内参质粒 pRL-TK 均由本实验室保存。3.1.3 载体和质粒

样品质量,样品,对照组,转录组

猪巨噬细胞感染不同基因型弓形虫后的转录组研究4. 结果与分析4.1 样品 RNA 质量检测的结果所有的 RNA 样品经过 Agilent 2100 Bioanalyzer 检测，结果显示所有的 RNA样品检测结果为合格，其中 RNA 样品的浓度均在 99 ng/ul 以上, RIN 值均在 9.0以上，28S 与 18S 的比值均大于 2.0，所有的 RNA 样品浓度和总量能够满足试验要求，为后续试验的准确性提供保证。

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