表达H9亚型禽流感病毒血凝素的重组火鸡疱疹病毒构建及其安全性与免疫效力试验
发布时间：2020-08-04 10:29
【摘要】：H9亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)对鸡的致病性低,仅引起轻微的呼吸道症状和短时间产蛋下降,但混合感染或继发感染其他病原可导致较高的发病率和死亡率。H9亚型禽流感对养鸡业危害较大,免疫接种是防控该病的主要策略之一。目前生产上常用的H9亚型禽流感疫苗为全病毒灭活疫苗,这类疫苗仅能诱导产生高水平的循环抗体,而不能有效地激发细胞免疫和黏膜免疫应答。近年来,以火鸡疱疹病毒(herpesvirus of turkey,HVT)为载体的重组病毒活疫苗已经成为研究热点。一方面,HVT具有较多的复制非必需区可供外源基因插入;另一方面HVT是常用的家禽疫苗,可供1日龄雏鸡免疫或18日龄胚内注射免疫,能够更早地诱导免疫应答。本研究旨在以HVT为载体,构建能稳定表达H9亚型AIV血凝素(HA)的重组病毒活疫苗候选毒株,与现有灭活疫苗组合使用,以提供更加有效的免疫保护。1.rHVT-YBF003株的构建及其遗传稳定性与安全性评价重组病毒构建:对近年分离的21株H9亚型AIV进行HA基因测序和遗传进化分析,发现这些毒株处于h9.4.2.5分支,为目前H9亚型AIV的优势流行毒株。因此,本研究选取其中的YBF003株,用于重组病毒的构建。采用RT-PCR扩增H9亚型AIV YBF003株的HA基因,将HA基因插入到含HVT FC-126疫苗株同源臂和CMV启动子的载体,构建转移载体pFR-H9。将pFR-H9与表达绿色荧光蛋白(EGFP)的重组HVT(rHVT-EGFP)基因组共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),以同源重组的方式将rHVT-EGFP的EGFP基因替换为HA基因表达盒,获得重组病毒rHVT-YBF003株。在CEF单层上反复纯化rHVT-YBF003株,直至所有重组病毒空斑均不带绿色荧光。经PCR鉴定,HA基因表达盒正确插入到HVT基因组;进一步进行Western-blot和IFA鉴定,rHVT-YBF003株能够表达HA蛋白。分别用rHVT-YBF003株和HVTFC-126株感染CEF,两者的生长特性并无显著差异。将rHVT-YBF003株在CEF上连续传20代,再接种于CEF单层,待形成典型空斑后,通过PCR从随机挑选的20个空斑中均能检测到HA基因表达盒;将第20代rHVT-YBF003株接种于CEF单层,通过间接免疫荧光试验(IFA)证明rHVT-YBF003株能够稳定表达H9亚型AIV的HA蛋白。重组病毒的遗传稳定性:1日龄SPF鸡颈部皮下接种rHVT-YBF003株,5.0×103 PFU/只;21日龄时,从血液中分离淋巴细胞,再接种于另一批次1日龄SPF鸡(3.0×106个淋巴细胞/羽份)。如此反复传代6次,经PCR检测传代后的rHVT-YBF003株中均存在HA基因,IFA证明传代后的重组病毒仍能稳定表达H9亚型AIV的HA蛋白。1日龄SPF鸡颈部皮下接种rHVT-YBF003株,5.0×103PFU/羽份;每隔7天采血分离淋巴细胞,再接种于CEF单层,进行病毒分离和计数。结果显示,rHVT-YBF003株在鸡体内的病毒载量不断提高,至9周龄时,病毒载量达到峰值,此后呈下降趋势,直到第20周龄时仍能检测到少量重组病毒存在,说明该重组病毒可在鸡体内维持较长时间。重组病毒的安全性:以5.0X 104PFU/羽份的rHVT-YBF003株接种1日龄SPF鸡,对鸡群进行连续8周的临床观察、生长状况监测,结果显示接种重组病毒的试验鸡精神、采食、饮水均正常,剖检和组织切片检查均未发现病理变化。以5.0×104PFU/头份的rHVT-YBF003株接种4周龄ICR小鼠,接种后ICR小鼠的采食、精神均正常;接种后14天,对小鼠内脏器官检查并称重,显示接种重组病毒对小鼠无不良影响。因此,重组病毒对易感动物和非易感动物均具有良好的安全性。2.rHVT-YBF003株的免疫效力评价对SPF鸡的免疫保护效力试验:试验分为4组,分别为胚内免疫组、1日龄免疫组、灭活疫苗组和空白对照组;分别对18日龄SPF鸡胚胚内注射5.0X 103PFU/羽份的rHVT-YBF003株、1日龄SPF雏鸡皮下注射5.0X 103PFU/羽份的rHVT-YBF003株、14日龄SPF雏鸡肌肉注射H9亚型禽流感病毒灭活疫苗(YBF003株)、1日龄SPF雏鸡皮下注射0.5 mLPBS/只。28日龄时,采血测定各试验组针对H9亚型AIV的HI抗体效价,并以H9亚型AIV YBF003株攻毒(静脉注射1.0X 1 07 5 EID50/羽份)。28日龄时,胚内免疫组和1日龄免疫组的HI抗体效价分别为4.7±0.60和4.5±0.30,胚内免疫组比1日龄免疫组的HI抗体最大提高0.3±0.62个滴度,两组均能提供一定的早期保护;灭活疫苗组的HI抗体效价为6.5±0.75,攻毒保护率为50%;空白对照组的抗体为1.3±0.12,攻毒保护率为0%。对商品鸡的免疫保护效力试验:对商品鸡的分组及处理方式同SPF鸡。另外,增加重组病毒与灭活疫苗联合免疫组,该组于1日龄时颈部皮下注射5.0×103PFU/羽份的rHVT-YBF003株,14日龄时经肌肉注射H9亚型禽流感病毒灭活疫苗(YBF003株)。28日龄时,采血测定各试验组针对H9亚型AIV的HI抗体效价,并以H9亚型AIV YBF003株攻毒(静脉注射1.0×107.5EID50/羽份)。28日龄时,胚内免疫组、1日龄免疫组和灭活疫苗免疫组的HI抗体效价分别为4.3±0.49、4.1 ±0.89和6.2±0.34,攻毒保护率均为50%以上,差异不显著;而联合免疫组的抗体效价为7.8±0.45,攻毒保护率为70%;空白对照组的抗体为1.0±0.74,攻毒保护率为10%。3.重组病毒种子批建立与大规模培养工艺研究培养工艺研究:为提高重组病毒的效价,同时获得规模化生产条件下的重组病毒培养技术参数。我们对采用细胞工厂进行大规模培养的方法进行了研究。结合该病毒的培养特性,分别从宿主细胞的接种密度、种毒接种剂量和收毒时间等方面对培养工艺进行摸索,最终制定了最优的病毒培养技术工艺:即采用十层细胞工厂(总面积为6335 cm2,培养液为1200mL),CEF密度为2.5×106个/mL时,接种3.0×106PFU的重组病毒,培养72 h,收获感染细胞,按照每个细胞工厂分装50支冻存管的标准进行收获,每支冻存管分装量为1.8mL,其收获的病毒效价可达5.0×106PFU/支以上,即成品疫苗可达5000 PFU/羽份以上,远高于2000 PFU/羽份的国家标准。种子批建立:将所收获的重组病毒分为原始种子、基础种子和生产种子。原始种子包括重组病毒的F1～F6代,基础种子包括F7～F12代,生产种子包括F13～F17代。并在各级种子批中随机选取一个代次的种子进行无菌检验、支原体检验、鉴别检验、安全性检验、免疫原性检验和外源病毒检验。无菌检验和支原体检验中,三个代次种毒的检验结果均为阴性;鉴别检验中,对HVT鉴定部分采用间接免疫荧光试验,结果显示,三个代次种毒形成的病毒空斑均呈现绿色荧光,说明形成的病毒空斑为HVT,对HVT表达的HA蛋白鉴定采用Western-blot方法鉴定,结果显示,三个代次种毒均能表达HA蛋白;安全性检验中,三个代次的种毒接种1日龄SPF鸡,免疫剂量为3.0×104PFU/羽,免疫后观察90天,所有免疫鸡均未观察到临床症状;外源病毒检验中,分别于1日龄和21日龄时,采用滴鼻、点眼(剂量为3.0×104PFU/羽份)和肌肉注射(剂量为3.0×104PFU/羽份)三种途径同时接种重组病毒,42日龄时采集血清,均未检测到外源病毒的抗体。结果显示,三个代次的重组病毒均符合种毒质量标准。综上所述,本研究构建了一株表达H9亚型AIV HA蛋白的重组HVT(rHVT-YBF003株)。在体内和体外传代过程中,rHVT-YBF003株所插入的HA基因均能稳定表达。在安全性评价方面,该重组病毒对易感和非易感动物均不具有致病性。该重组病毒可用于1日龄雏鸡和18日龄鸡胚内的早期免疫,虽然HI抗体低于灭活疫苗,但对H9亚型AIV的保护率等同于灭活疫苗。重组病毒与灭活疫苗联合使用具有协同效应,对H9防控效果更好。本研究还建立了种子批,并制定了符合大规模生产的重组病毒培养工艺,为将来工厂化生产打下了基础。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：
括囊膜纤突蛋白血凝素（ＨＡ）和神经氨酸酶（ＮＡ），以及核蛋白（ＮＰ）、三个聚合酶逡逑蛋白（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）、两个基质蛋白（Ｍｌ、Ｍ２）和两个非结构蛋白（ＮＳ１、ＮＳ２），逡逑如图１．１所示［５＿７］。逡逑１．１邋ＨＡ基因的结构和功能逡逑血凝素蛋白（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，邋ＨＡ）以三聚体呈棒状结构，属于Ｉ型跨膜蛋白，其竣基逡逑端镶嵌于病毒囊膜中，亲水的氨基端则突出于病毒粒子表面，是流感病毒囊膜纤突的主逡逑要成分之一［８］。ＨＡ蛋白作为囊膜表面的糖蛋白，位于流感病毒识别宿主细胞表面受体的逡逑功能区域，在病毒的感染和复制过程中发挥着重要的作用。逡逑
ＭＤＶ具有较大基因组结构，由一个长独特区（ＵＬ），邋—个短独特区（ＵＳ），逡逑以及独特区两侧的相同插入重复片段，长重复序列（ＴＲＬ）邋／内部重复序列（ＩＲＬ），连同逡逑短重复序列（ＴＲＳ）邋／内部短重复序列（ＩＲＳ）构成（如图３．１所示）。在病毒基因组的短逡逑独特区（ＵＳ）为病毒生长的非必需区，在这些复制非必需区中插入大片段的外源基因不会逡逑影响病毒的复制，因此可选用ＭＤＶ作为活病毒载体通过构建的转移载体质粒与马逡逑立克氏病病毒基因组共转染的方法构建重组病毒。在属于疱疹病毒复制非必X目寺″义掀沃胁迦胨泶锏耐庠椿蚣捌溆泄氐骺卦雇庠椿虻牧讲嘤涤杏肭妆静《惧义贤吹男蛄小Ｍü粗刈榈姆绞剑雇庠椿虿迦氲讲《局校靶纬刹《究帕！ｅ义嫌檬实钡姆椒ń浞掷氪炕佣玫侥鼙泶锿庠椿虻闹刈椴《尽ｅ义希撸危危桑慑澹卞危卞巍义希裕遥体澹眨体澹桑遥体澹桑遥渝澹眨渝澹裕遥渝义贤迹常别逭畈《净蜃橄咝越峁雇迹ㄕ裕豪钕啵砹⒖耸襄义喜《痉肿由镅а衃偨梗邸觯。荩澹玻埃保担澹保玻ǎ常叮哄澹担福担梗╁义希疲椋珏澹常卞澹蹋椋睿澹幔蝈澹螅簦颍酰悖簦酰颍邋澹铮驽澹瑁澹颍穑澹箦澹觯椋颍酰箦澹纾澹睿铮恚邋义希停模肿魑畈《驹靥寰哂幸韵碌挠诺悖弧ⅲ停模治赴岷闲圆《荆呙缑庖咤义系募芍丈
本文编号：2780420
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：
括囊膜纤突蛋白血凝素（ＨＡ）和神经氨酸酶（ＮＡ），以及核蛋白（ＮＰ）、三个聚合酶逡逑蛋白（ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２）、两个基质蛋白（Ｍｌ、Ｍ２）和两个非结构蛋白（ＮＳ１、ＮＳ２），逡逑如图１．１所示［５＿７］。逡逑１．１邋ＨＡ基因的结构和功能逡逑血凝素蛋白（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ，邋ＨＡ）以三聚体呈棒状结构，属于Ｉ型跨膜蛋白，其竣基逡逑端镶嵌于病毒囊膜中，亲水的氨基端则突出于病毒粒子表面，是流感病毒囊膜纤突的主逡逑要成分之一［８］。ＨＡ蛋白作为囊膜表面的糖蛋白，位于流感病毒识别宿主细胞表面受体的逡逑功能区域，在病毒的感染和复制过程中发挥着重要的作用。逡逑
ＭＤＶ具有较大基因组结构，由一个长独特区（ＵＬ），邋—个短独特区（ＵＳ），逡逑以及独特区两侧的相同插入重复片段，长重复序列（ＴＲＬ）邋／内部重复序列（ＩＲＬ），连同逡逑短重复序列（ＴＲＳ）邋／内部短重复序列（ＩＲＳ）构成（如图３．１所示）。在病毒基因组的短逡逑独特区（ＵＳ）为病毒生长的非必需区，在这些复制非必需区中插入大片段的外源基因不会逡逑影响病毒的复制，因此可选用ＭＤＶ作为活病毒载体通过构建的转移载体质粒与马逡逑立克氏病病毒基因组共转染的方法构建重组病毒。在属于疱疹病毒复制非必X目寺″义掀沃胁迦胨泶锏耐庠椿蚣捌溆泄氐骺卦雇庠椿虻牧讲嘤涤杏肭妆静《惧义贤吹男蛄小Ｍü粗刈榈姆绞剑雇庠椿虿迦氲讲《局校靶纬刹《究帕！ｅ义嫌檬实钡姆椒ń浞掷氪炕佣玫侥鼙泶锿庠椿虻闹刈椴《尽ｅ义希撸危危桑慑澹卞危卞巍义希裕遥体澹眨体澹桑遥体澹桑遥渝澹眨渝澹裕遥渝义贤迹常别逭畈《净蜃橄咝越峁雇迹ㄕ裕豪钕啵砹⒖耸襄义喜《痉肿由镅а衃偨梗邸觯。荩澹玻埃保担澹保玻ǎ常叮哄澹担福担梗╁义希疲椋珏澹常卞澹蹋椋睿澹幔蝈澹螅簦颍酰悖簦酰颍邋澹铮驽澹瑁澹颍穑澹箦澹觯椋颍酰箦澹纾澹睿铮恚邋义希停模肿魑畈《驹靥寰哂幸韵碌挠诺悖弧ⅲ停模治赴岷闲圆《荆呙缑庖咤义系募芍丈
本文编号：2780420
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