猪ZBED6基因和Tβ4基因启动子核心区序列分析

发布时间：2020-08-05 10:21

【摘要】：本课题组在前期民猪冷应激实验中筛选出ZBED6基因和Tβ4基因,二者表达均存在显著差异,以与肌肉生长发育相关的ZBED6基因和与毛囊发育、毛发生长显著相关的Tβ4基因为目的基因,分析启动子活性、筛选转录因子,以研究对民猪生长性状的转录调控的影响。锌指蛋白ZBED6(zinc finger bed domain containing 6,ZBED6)基因的突变,可促进骨骼肌中胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)转录水平的显著上调,从而促进细胞增殖和肌管形成。ZBED6的过表达不仅可以抑制IGF2的转录,还能调控下游上千个与发育类疾病、癌症和心血管疾病密切相关的重要基因。但关于该基因转录调控的作用机理目前尚不清楚,有待研究。胸腺素β4(thymosin beta4,Tβ4)基因是一个与毛囊发育和毛发生长显著相关的基因。利用胸腺素β4干预毛囊外毛根鞘细胞,其增殖效应明显,说明胸腺素β4通过刺激毛囊外毛根鞘细胞增殖分化能够促进毛囊生长,然而具体作用机制尚不明确。本研究利用分子生物学技术对ZBED6基因和Tβ4基因的5′端序列进行克隆,通过生物信息学方法预测两种基因潜在的转录因子结合位点,构建ZBED6基因和Tβ4基因5′端序列不同长度缺失片段的报告基因荧光表达载体,利用双荧光素酶报告系统对两种基因的启动子区进行活性分析,利用缺失突变和过表达技术确定两个基因的转录调控元件,获得主要研究结果如下:(1)以翻译起始密码子的“A”为+1,克隆得到猪ZBED6基因-2053~-21 bp序列,经双荧光素酶报告系统检测,具有启动子活性。分段缺失后发现最小活性区域位于-1808~-1777 bp之间,存在正调控元件。(2)利用在线软件预测ZBED6基因的-1808~-1777 bp区域内,存在CREMtaul、NKx2-5(var.2)、HINFP、Adf-1和CREB3五个转录因子结合位点。突变掉Adf-1和CREB3的识别位点能够极显著降低ZBED6基因的启动子活性(P0.01)。但过表达CREB3元件,不能促进ZBED6基因的表达,说明(-2041/-1565)-pGL3区域内GACGT序列不是CREB3的结合位点。由于猪的Adf-1序列未知,暂只能确定ZBED6基因的最小活性区域在-1808~-1777 bp内。(3)以翻译起始密码子的“A”为+1,克隆得到猪Tβ4基因-1218~+29 bp序列,经双荧光素酶报告系统检测,具有启动子活性。分段缺失发现最小活性区域位于-155~-105 bp之间,存在正调控元件。(4)利用生物信息学软件预测Tβ4基因的-155~-105 bp区域内,存在ELK-1、MYBAS1和E2F-1三个转录因子结合位点。突变掉ELK-1识别位点能够显著降低Tβ4基因的启动子活性(P0.05)。过表达分析ELK-1转录元件可以促进Tβ4基因的表达,证明ELK-1是Tβ4基因转录调控的关键因子。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S828
【图文】：

引 言1 引言1.1 启动子概述1.1.1 启动子结构真核生物基因表达调控的过程极为复杂，包括转录、加工、翻译等，而转录是基因表达调控的起始过程，也是极为重要的一步[1]，生物体的生长和发育受基因表达的调控，由于启动子是调控基因表达的重要元件，因此研究启动子的结构与功能，对于从分子层面上更好地了解生物的生长发育、疾病治疗等都具有重要意义[2]。启动子是位于基因 5′端上游并能够与 RNA 聚合酶特异性识别和结合的一段 DNA 序列，具有起始转录的功能，真核生物启动子的转录原理比原核复杂，包含核心启动子元件和上游启动子两种元件。

基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定

（-2053/-21）-ZBED6片段PCR扩增

【参考文献】

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本文编号：2781411