鸡源Shp-2的克隆表达、单抗研制以及敲除Shp-2的鸡肝细胞系构建
发布时间：2020-08-07 22:41
【摘要】：Src同源区2(SH2)蛋白酪氨酸磷酸酶2(Shp-2)是一种非受体酪氨酸磷酸酶,在各种脊椎动物的细胞中普遍表达,参与细胞的分化等多种生物学功能的调控及信号转导过程。作为原癌基因PTPN11编码的酪氨酸磷酸酶,Shp-2的表达及其活性改变已被证明与造血细胞的恶性增生、儿童白血病及多种人的恶性肿瘤疾病有关。然Shp-2在禽类疾病中所起的作用研究鲜见报道。为探究鸡源Shp-2功能及其在相关疾病中作用,本研究在克隆、表达了鸡源Shp-2基因的基础上,研制出了针对鸡Shp-2的特异性单克隆抗体,且利用CRISPR-Cas9技术建立了稳定敲除Shp-2的鸡肝细胞系。1、鸡Shp-2基因克隆及表达为获得用于制备抗鸡Shp-2单克隆抗体的免疫原和筛选抗原,本研究将Shp-2基因克隆至线性化载体pGEX-6p-1和pcDNA3.1上,成功构建了 Shp-2原核表达载体pGEX-6P-1-Shp-2 及真核表达载体 pcDNA3.1-Shp-2。将获得的阳性重组子pGEX-6P-1-Shp-2转化至Rosetta感受态中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现GST-Shp-2蛋白可以以包涵体形式以及可溶性形式表达。Western blot分析证明重组蛋白GST-Shp-2具有良好的抗原反应性。利用GST琼脂糖凝胶柱纯化了可溶性形式表达的GST-Shp-2蛋白,为后续小鼠免疫及抗鸡Shp-2单克隆抗体的制备提供了生物材料,奠定了基础。2、抗鸡Shp-2单克隆抗体的制备及特性鉴定为获得抗鸡Shp-2单克隆抗体,本研究将纯化的GST-Shp-2免疫BALB/c小鼠,以转染pcDNA3.1-Shp-2的DF-1细胞为筛选抗原,通过IFA筛选出两株能够分泌出抗鸡Shp-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为3A10和3G12,亚类均为IgG1,轻链均为κ链。3A10和3G12的IFA荧光效价测定均为1:12800,且Western blot试验表明这两株单抗与内源性和外源性表达的Shp-2均能发生特异性反应。通过对单抗3A10和3G12的初步表位鉴定表明,这两株单抗的表位均跨越了 NSH2和CSH2两个重要功能结构域。两株抗Shp-2单克隆抗体的获得为研究Shp-2的生物学功能提供了材料。3、敲除Shp-2的鸡肝细胞系的建立为探究Shp-2与禽类疾病的关系,本研究利用CRISPR/Cas9技术建立了敲除Shhp-2基因的LMH细胞系。首先将设计的针对Shp-2基因的5条sgRNA克隆至lentiCRISPRv2载体,将重组质粒转染LMH细胞,嘌呤霉素筛选。通过Western blot技术检测发现,sgRNA-3的敲除效果最好。通过将转染lentiCRISPRv2-sgRNA-3的LMH细胞单克隆化,Western blot检测单克隆细胞株的Shp-2的蛋白水平,最后获得稳定敲除Shp-2的LMH细胞系,命名为 LMH-KO-Shp-2-3、LMH-KO-Shp-2-6、LMH-KO-Shp-2-11,为研究 Shp-2 在禽类疾病中的作用提供有力工具。
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.31
【图文】：
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本文编号：2784623
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S858.31
【图文】：
外一步克隆方法（ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ邋ＩＩ邋ｋｉｔ）。将以上回收得到的线性化载体ｐＧＥＸ－６ｐ－ｌ和逡逑ｐｃＤＮＡ３．１、相对应的两种Ｓｈｐ－２目的基因片段在本产品提供的重组酶ＥｘｎａｓｅＴＭ邋ＩＩ作用下逡逑进行体外重组反应，重组的流程见图１－１。逡逑下葙弓丨物逦上？５１物逡逑上邋８普邋一－Ａ逡逑（邋ｐＧＥＸ４ｐ４／ｐｃＤ？ｆＡ３．ｉ｜ｉ粒逦＇）逦逦逦逡逑＾逦下？邋引物逡逑｜邋ＰＣＲ逦丨邋ＰＣＲ邋ｆ邋Ｊｔ逡逑命逦Ｊ载体〉逦Q\0４—的—逡逑逦邋逦逡逑＜Ｓ＞Ｐ｜逡逑体外重组逦Ｅｘｎａｓｅ？邋ＩＸ逡逑%煎澹危殄义献赣希殄危蓿浚藻澹樱颍荆锲尾罚у义希恚恚恚恚礤澹叔义稀义贤迹保笔褂茫茫欤铮睿牛穑颍澹螅箦澹桑山屑唬荆不蚩寺∈笛榱鞒体义希疲椋纾澹保卞澹校颍铮悖澹洌酰悖邋澹铮驽澹悖欤铮睿椋睿珏澹樱瑁穑插澹纾澹睿邋澹鳎椋簦桢澹茫欤铮睿牛穑颍澹螅箦澹桑慑义希玻矗仓刈榉从Ψ椒ㄥ义辖厦妫玻常步夯厥栈竦玫南咝曰靥澹穑牵牛兀叮穑旌停穑悖模危粒常薄⑾喽杂Φ牧街旨穑插义夏康幕蚱尾獾煤怂崤ǘ群螅荩茫欤铮睿牛穑颍澹螅箦澹桑杉际跛得魇橹蟹椒ń兄刈椋从μ邋义舷等绫恚保丁ｅ义
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