宿主波形蛋白与口蹄疫病毒非结构蛋白3A相互作用机制研究
发布时间：2020-08-09 00:49
【摘要】：口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease,FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease viruse,FMDV)引起偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触传染性的动物疫病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的头号烈性传染病,我国将其列为Ⅰ类动物传染病。作为畜牧业大国之一,我国每年饲养猪、牛、羊等多达18亿头。口蹄疫的爆发和流行对我国养殖业造成了严重危害。目前,FMDV感染的致病机制仍未完全揭示。FMDV作为一种专性活细胞内寄生的生物,在FMDV复制复合物形成的过程中,病毒蛋白与宿主蛋白发生广泛的相互作用。前期我们利用免疫共沉淀技术,发现FMDV的非结构蛋白3A可以与宿主波形蛋白(Vimentin)相互作用,为研究其作用机制进行了以下研究:1、利用GST-pull down和激光共聚焦共定位的方法确定FMDV 3A与vimentin之间的相互作用。为了进一步确定3A与vimentin互作的关键氨基酸位点,研究表明该FMDV 3A存在多个氨基酸位点与vimentin相互作用,将FMDV 3A蛋白进行丙氨酸突变扫描,通过GST-pull down的方法进行鉴定,结果表明FMDV 3A蛋白上第15-21位氨基酸是与vimentin互作的关键氨基酸。这说明FMDV 3A与vimentin相互作用的位点位于FMDV 3A蛋白的N端。2、本研究将FMDV感染后不同时间点的细胞分别进行免疫荧光实验Westernblotting和Real time PCR分析。免疫荧光实验结果表明:FMDV感染PK-15细胞可导致vimentin在细胞内的分布发生变化,正常细胞中vimentin均匀分布在细胞质中,随着病毒感染时间的延长(3 h-4 h),vimentin聚集在细胞核一侧,在病毒感染后5 h,vimentin呈“笼子”结构聚集在细胞核周围,且FMDV感染细胞1 h-5 h,3A与vimentin始终共定位。Westernblotting和Real time PCR结果表明:在FMDV感染初期,宿主vimentin蛋白表达水平和mRNA转录水平有短暂的下降,随着FMDV感染时间的延长,宿主vimentin蛋白表达水平和mRNA转录水平逐渐升高,但在FMDV感染的过程中,宿主vimentin蛋白没有被切割。这说明FMDV感染导致宿主vimentin发生重排,且vimentin发生重排不是由于vimentin被切割导致。在FMDV感染过程中,vimentin这种先下降后升高的表达方式与FMDV感染后与宿主之间复杂的相互作用有关,vimentin蛋白可能参与FMDV感染的多个过程,而且在不同的过程中发挥着不同的作用,从而使得vimentin蛋白表达相应地在不同时间出现差异。3、将外源表达的vimentin进行纯化复性,并利用vimentin蛋白阻断PRRSV侵染Marc-145细胞,以验证复性后vimentin具有生物活性,再将其与FMDV感作2 h后侵染细胞,利用Real time PCR(绝对定量)检测病毒感染12 h后细胞内病毒拷贝数,发现vimentin并没有对FMDV感染造成影响。随后又通过细胞流式法确定vimentin仅分布于细胞质基质中,而不存在于细胞外膜表面。表明vimentin在FMDV的吸附和进入细胞的过程中不发挥作用。综上,这些实验结果证明vimentin在FMDV吸附和侵入细胞的过程中不发挥作用,但在FMDV感染过程中可与FMDV 3A蛋白相互作用,为深入阐明FMDV感染致病机制提供重要信息,为预防和控制FMDV感染提供新思路。
【学位授予单位】：西北民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：
2.4.3 激光共聚焦扫描观察在共聚焦专用载玻片上滴一滴去离子水，小心取出爬片，使其背面朝上置玻片水滴上，并确保无气泡产生，加一滴 10%的甘油于爬片背面，倒置于激聚焦显微镜载物台上，用DIPA、FITC、Cy3激发光激发荧光，观察3A与vimen置分布并拍照记录结果。2.5 丙氨酸扫描确定 3A 关键结合位点以 3A 氨基酸序列中相邻的 7 个氨基酸为一组，逐个进行丙氨酸突变扫描（ 2-1），共获得 22 个 3A 突变体，由金唯智公司合成。将这些质粒进行转化导表达，与 vimentin 进行 GST-pull down，以验证与 vimentin 结合的 3A 关用氨基酸位点。Westernblotting 检测时，一抗分别为鼠源抗 GST 单抗印迹 3源抗 vimentin 单抗印迹波形蛋白。
以质粒 pSKM1234 为模板，用设计的特异性引物通过 PCR 扩增 3A 片段，进行琼脂糖凝胶电泳检测分析，扩增条带大小与预期值相符（如图 2-2）。图2-2 目的基因3A的扩增Fig.2-2 The PCR Amplication for 3AM:DNA 分子质量标准;1:PCR 扩增产物M:1Kb DNAmarker; 1:3Agene Amplified by PCR3.1.2 构建诱饵重组质粒将 PCR 扩增的 3A 经 Bam H I 和 Not I 双酶切后，插入 pGEX-6p-1 载体的相同酶切位点上，获得 3A-pGEX-6p-1 重组质粒，送上海生物工程有限公司测序成功，且结果表明 3A 已成功插入 pGEX-6p-1 载体中。3.1.3 重组 3A 的诱导表达及 Westernblotting 鉴定将重组质粒 3A-pEGX-6p1 转化 E.coli BL21(DE3)感受态细胞，经 IPTG 诱导后，超声破碎菌体，离心取上清和沉淀分别进行 SDS-PAGE 分析。GST 标签大小为 26 KD 左右，所以预期目的蛋白大小为 46 KD
M 1 2 3因此可鉴定表达产物为预期重组蛋白（见图 2-4)。图2-3 重组菌3A表达产物的SDS-PAGE分析Fig.2-3 Analysis of SDS-PAGE form the recombinant bacteriaM:蛋白质分子质量标准；1:诱导后重组菌表达产物;2:超声波破解后上清3:超声波破解后沉淀M:Protein molecular weight Marker;1:Recombinant bacteria without induction;2:Supernatant afterultrasonic disruption;3.Pellets after ultrasonic disruption;图2-4 重组菌3A表达产物的Westernblotting分析Fig.2-4 Analysis of Westernblotting form the recombinant bacteriaM:蛋白质分子质量标准；1:超声波破解后沉淀;2:超声波破解后上清3:诱导后重组菌表达产物M:Protein molecular weight Marker;1:;2:Pellets after ultrasonic disruptionSupernatant afterultrasonic disruption;3.Recombinant bacteria without induction1 2 3 M55KD40KD55KD40KD
本文编号：2786340
【学位授予单位】：西北民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：
2.4.3 激光共聚焦扫描观察在共聚焦专用载玻片上滴一滴去离子水，小心取出爬片，使其背面朝上置玻片水滴上，并确保无气泡产生，加一滴 10%的甘油于爬片背面，倒置于激聚焦显微镜载物台上，用DIPA、FITC、Cy3激发光激发荧光，观察3A与vimen置分布并拍照记录结果。2.5 丙氨酸扫描确定 3A 关键结合位点以 3A 氨基酸序列中相邻的 7 个氨基酸为一组，逐个进行丙氨酸突变扫描（ 2-1），共获得 22 个 3A 突变体，由金唯智公司合成。将这些质粒进行转化导表达，与 vimentin 进行 GST-pull down，以验证与 vimentin 结合的 3A 关用氨基酸位点。Westernblotting 检测时，一抗分别为鼠源抗 GST 单抗印迹 3源抗 vimentin 单抗印迹波形蛋白。
以质粒 pSKM1234 为模板，用设计的特异性引物通过 PCR 扩增 3A 片段，进行琼脂糖凝胶电泳检测分析，扩增条带大小与预期值相符（如图 2-2）。图2-2 目的基因3A的扩增Fig.2-2 The PCR Amplication for 3AM:DNA 分子质量标准;1:PCR 扩增产物M:1Kb DNAmarker; 1:3Agene Amplified by PCR3.1.2 构建诱饵重组质粒将 PCR 扩增的 3A 经 Bam H I 和 Not I 双酶切后，插入 pGEX-6p-1 载体的相同酶切位点上，获得 3A-pGEX-6p-1 重组质粒，送上海生物工程有限公司测序成功，且结果表明 3A 已成功插入 pGEX-6p-1 载体中。3.1.3 重组 3A 的诱导表达及 Westernblotting 鉴定将重组质粒 3A-pEGX-6p1 转化 E.coli BL21(DE3)感受态细胞，经 IPTG 诱导后，超声破碎菌体，离心取上清和沉淀分别进行 SDS-PAGE 分析。GST 标签大小为 26 KD 左右，所以预期目的蛋白大小为 46 KD
M 1 2 3因此可鉴定表达产物为预期重组蛋白（见图 2-4)。图2-3 重组菌3A表达产物的SDS-PAGE分析Fig.2-3 Analysis of SDS-PAGE form the recombinant bacteriaM:蛋白质分子质量标准；1:诱导后重组菌表达产物;2:超声波破解后上清3:超声波破解后沉淀M:Protein molecular weight Marker;1:Recombinant bacteria without induction;2:Supernatant afterultrasonic disruption;3.Pellets after ultrasonic disruption;图2-4 重组菌3A表达产物的Westernblotting分析Fig.2-4 Analysis of Westernblotting form the recombinant bacteriaM:蛋白质分子质量标准；1:超声波破解后沉淀;2:超声波破解后上清3:诱导后重组菌表达产物M:Protein molecular weight Marker;1:;2:Pellets after ultrasonic disruptionSupernatant afterultrasonic disruption;3.Recombinant bacteria without induction1 2 3 M55KD40KD55KD40KD
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 李昊;李义;高建梅;;免疫共沉淀技术的研究进展[J];内蒙古医学杂志;2008年04期
本文编号：2786340
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