羊肠道病毒小鼠感染模型的建立及病毒组织嗜性的研究
发布时间：2020-08-09 04:40
【摘要】：肠道病毒(enterovirus,EV)为小RNA病毒科肠道病毒属的成员,是导致人类与动物的消化、神经和呼吸系统疫病的重要病原体。根据病毒最新分类,肠道病毒属分为12个肠道病毒种和3个鼻病毒种。A、B、C、D种肠道病毒主要感染人,E种和F种主要感染牛,G种主要感染猪,H种和J种主要感染灵长类动物。I、K、L种肠道病毒为新的肠道病毒种。本实验室于2014年从吉林省某规模化养羊场暴发的临床上以呼吸困难、严重腹泻、发病率和致死率高达50-80%为特征的病羊体内分离到山羊肠道病毒CEV-JL14,首次确定了国内羊群存在肠道病毒感染。由于羊肠道病毒感染为国内新发疫病,有关本病的诊断、流行病学及病毒的致病机理等方面缺乏研究。本研究以分离的山羊肠道病毒CEV-JL14实验感染乳鼠,建立了羊肠道病毒感染小鼠模型。应用病毒感染不同品系的小鼠,确定出ICR小鼠为羊肠道病毒易感小鼠品系。同时以2×10~8 TCID_(50)病毒液,分别通过腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种ICR乳鼠,发现各种接种途径均可感染小鼠。以不同剂量病毒感染乳鼠,确定出羊肠道病毒CEV-JL14感染小鼠的最低感染剂量为2×10~6 TCID_(50)。应用RT-PCR方法,检测CEV-JL14病毒感染小鼠后不同时间的器官组织,确定出ICR小鼠感染病毒后带毒时间至少可持续16天。组织病理学检查显示,病毒感染引起乳鼠出现明显的组织病理学变化。心肌间质水肿,心肌细胞变性,且局部有淋巴细胞浸润。肝细胞肿胀,发生颗粒变性和水泡变性,肝脏组织中有大量的淋巴细胞和炎性细胞浸润。脾脏淋巴细胞增多,细胞坏死,红髓区有炎性细胞聚集。肺脏肺泡壁增厚,炎性细胞浸润,有明显的出血、淤血。肾脏肾小管上皮细胞颗粒变性,有淋巴细胞浸润。肠绒毛脱落,小肠绒毛空泡变性,肠粘膜上皮细胞肿胀。脑神经元存在不同程度空泡变性,神经元变性坏死,数量减少,脑室脉络丛大量淋巴细胞浸润。肌肉局部间质水肿,大量淋巴细胞浸润,少量纤维组织增生。应用免疫组织化学方法确定感染小鼠组织中的病毒抗原,发现感染小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、脑、肌肉组织中均能检测到羊肠道病毒病毒抗原,其中病毒抗原在心肌、肌肉、肝脏、肺脏中明显高于其他组织。综上所述,本研究成功建立了羊肠道病毒感染小鼠模型,确定出病毒的易感小鼠品系,病毒感染小鼠的途径与最低剂量,病毒的组织亲嗜性。该结果为进一步研究羊肠道病毒的致病机理、病毒感染诱导的免疫机理及疫苗研制奠定基础。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：
图 1.1 病毒基因组结构[18]1.3.2 肠道病毒基因编码的蛋白及其功能1.3.2.1 VPg 蛋白及其功能肠道病毒属的成员都含有一个大的 ORF，编码一个大约为 2178-2332 个氨基酸的前体多聚蛋白。翻译蛋白的时候，多聚蛋白不断被水解成小片段蛋白。5’UTR的 IRES 是一个顺式作用元件，形成二级的 RNA 结构，并且也形成三级的 RNA结构，并且病毒的 RNA 能够借用细胞翻译装置[19]。一个合理的二、三级结构以及一些茎环结构的生成，对由小 RNA 病毒 IRES 启动的内部翻译来说是至关重要的[26]。IRES 介导的病毒翻译，与 IRES 识别相关的翻译因子有关。IRES 依赖性翻译，需要大量的 ITAFs 因子来招募核糖体并启动翻译。这些蛋白可以作为IRES 的伴侣，结合在 RNA 的多个域，并且稳定整个 IRES 的结构，这对结合的翻译因子来说很合适。很多报道表示 ITAFs 的活动是依赖于它们的亚细胞定位[26,
图 2.1 CEV 感染乳鼠品系的确定000 DNA Marker；1-3：分别为接种病毒的 ICR、BALB样品；4-6：分别为接种 DMEM 的 ICR、BALB/c 和 K7：阳性对照；8：阴性对照。EV 易感乳鼠的途径确定 CEV 感染途径，我们以 5 种不同感染方式（腹腔注射注射、灌胃、滴鼻）给乳鼠接种 2 ×108TCID50病毒液，组织中 CEV 进行检测。结果如图 2.2 所示，五种途径接种乳小与预期条带大小一致，经过核苷酸序列测定，确定为 CEV-现腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种的乳仍然选取皮下注射进行后续实验。
图 2.2 CEV 乳鼠感染途径的确定M：DL2000 DNA Marker；1-5：分别为腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种病毒液的乳鼠组织样品；6-10：分别为腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种 DMEM 的乳鼠组织样品；11：阳性对照；12：阴性对照。2.3.4 CEV 易感乳鼠的最低感染剂量为了确定 CEV 易感乳鼠最低感染剂量，选取 4 窝 3 日龄 ICR 乳鼠，分别命名为 A、B、C 和 D 组，对 A、B、C 组每只乳鼠分别以颈部皮下注射 2×104TCID50、2×106TCID50、2×108TCID50感染剂量的病毒液，对 D 组每只乳鼠注射相同体积的 DMEM 细胞培养液。接种 5 天后处死各组的乳鼠，收集各组织、器官并提取乳鼠组织 RNA，再通过 RT-PCR 检测 CEV 基因片段，结果如图 2.3 所示，乳鼠感染剂量为 2×104TCID50病毒时，并未出现目的条带，当感染剂量分别达到 2×106
本文编号：2786621
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.65
【图文】：
图 1.1 病毒基因组结构[18]1.3.2 肠道病毒基因编码的蛋白及其功能1.3.2.1 VPg 蛋白及其功能肠道病毒属的成员都含有一个大的 ORF，编码一个大约为 2178-2332 个氨基酸的前体多聚蛋白。翻译蛋白的时候，多聚蛋白不断被水解成小片段蛋白。5’UTR的 IRES 是一个顺式作用元件，形成二级的 RNA 结构，并且也形成三级的 RNA结构，并且病毒的 RNA 能够借用细胞翻译装置[19]。一个合理的二、三级结构以及一些茎环结构的生成，对由小 RNA 病毒 IRES 启动的内部翻译来说是至关重要的[26]。IRES 介导的病毒翻译，与 IRES 识别相关的翻译因子有关。IRES 依赖性翻译，需要大量的 ITAFs 因子来招募核糖体并启动翻译。这些蛋白可以作为IRES 的伴侣，结合在 RNA 的多个域，并且稳定整个 IRES 的结构，这对结合的翻译因子来说很合适。很多报道表示 ITAFs 的活动是依赖于它们的亚细胞定位[26,
图 2.1 CEV 感染乳鼠品系的确定000 DNA Marker；1-3：分别为接种病毒的 ICR、BALB样品；4-6：分别为接种 DMEM 的 ICR、BALB/c 和 K7：阳性对照；8：阴性对照。EV 易感乳鼠的途径确定 CEV 感染途径，我们以 5 种不同感染方式（腹腔注射注射、灌胃、滴鼻）给乳鼠接种 2 ×108TCID50病毒液，组织中 CEV 进行检测。结果如图 2.2 所示，五种途径接种乳小与预期条带大小一致，经过核苷酸序列测定，确定为 CEV-现腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种的乳仍然选取皮下注射进行后续实验。
图 2.2 CEV 乳鼠感染途径的确定M：DL2000 DNA Marker；1-5：分别为腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种病毒液的乳鼠组织样品；6-10：分别为腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、灌胃、滴鼻途径接种 DMEM 的乳鼠组织样品；11：阳性对照；12：阴性对照。2.3.4 CEV 易感乳鼠的最低感染剂量为了确定 CEV 易感乳鼠最低感染剂量，选取 4 窝 3 日龄 ICR 乳鼠，分别命名为 A、B、C 和 D 组，对 A、B、C 组每只乳鼠分别以颈部皮下注射 2×104TCID50、2×106TCID50、2×108TCID50感染剂量的病毒液，对 D 组每只乳鼠注射相同体积的 DMEM 细胞培养液。接种 5 天后处死各组的乳鼠，收集各组织、器官并提取乳鼠组织 RNA，再通过 RT-PCR 检测 CEV 基因片段，结果如图 2.3 所示，乳鼠感染剂量为 2×104TCID50病毒时，并未出现目的条带，当感染剂量分别达到 2×106
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 邢泽黎;朱利塞;王新平;李苏靖;郭昌明;杨丽;;从吉林省肉牛场新发疫病分离出E种肠道病毒[J];中国兽医学报;2014年03期
2 彭小薇;董浩;吴丹;张鹤晓;吴清民;吕艳丽;;牛肠道病毒2型的分离与鉴定[J];畜牧兽医学报;2013年05期
3 李英利;常继涛;于力;;牛肠道病毒的分离鉴定[J];中国预防兽医学报;2011年05期
相关博士学位论文 前1条
1 朱利塞;E种肠道病毒HY12准种与进化及VP1基因突变对病毒复制的影响[D];吉林大学;2017年
本文编号：2786621
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