鸡骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定

发布时间：2020-08-09 16:07

【摘要】：骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells BMSCs)是在骨髓中发现的一种成体多能祖细胞,能够支持造血干细胞的生长,被分离后可在体外进行扩增而不会丧失多能性,在特定条件下还能分化成成骨,软骨,脂肪,肌肉,神经,内皮等多种间充质谱系组织,目前被广泛用于再生医学、组织工程、禽类发育生物学以及生产嵌合体等研究。目前有关BMSCs的研究多集中于人、鼠、兔和羊等哺乳动物,鲜有鸡BMSCs研究的相关报道。所以,鸡BMSCs的分离纯化以及体外培养体系的建立势在必行。本研究旨在建立鸡BMSCs分离培养体系,为进一步利用BMSCs生产转基因鸡以及细胞水平上的基因编辑奠定基础。本试验选择了 1-15日龄的广西黄羽鸡作为试验材料。首先无菌分离出鸡的股骨和胫骨并剪除股骨和胫骨的两骨骺端,然后用D-PBS或基础培养基(DMEM/F12)冲洗出全部骨髓,随后通过Ficoo1400密度梯度离心法对BMSCs进行初步纯化,最后在传代培养过程中通过差速消化差速贴壁的方法对BMSCs进行再次纯化。当分离培养的BMSCs纯度达到90%以上时,通过形态学观察、增殖动力学检测、集落形成能力试验、组织化学检测、RT-PCR分析对其初步鉴定,之后再通过体外分化试验和嵌合体试验对其进行进一步鉴定。其中组织化学检测主要运用了糖原染色(PAS)、碱性磷酸酶检测(ALP)、细胞表面标志物的免疫荧光检测(IF)、油红O染色等方法;RT-PCR分析试验则是通过设计相关引物来检测细胞是否表达BMSCs细胞表面的几种标志物基因,和控制多能性的几种转录因子;体外分化试验则是对BMSCs进行了成脂细胞和成骨细胞定向诱导分化,然后通过组织化学检测和RT-PCR分析来验证分化结果;嵌合体试验是通过将EDU标记的BMSCs注射到孵育53小时的鸡胚背主动脉中,然后通过换壳培养继续孵育,在第7天和11天时检测鸡胚中的EDU信号的方法进行。细胞形态学观察表明本研究所分离的细胞接种到细胞培养皿后,会在12-24h贴壁,细胞形态会从圆形逐渐变为纺锤形、椭圆形、扁平形等多种形状。在用差速消化差速贴壁的方法对其进行进一步纯化的过程中,细胞形态趋于统一并表现为典型的成纤维状。增殖动力学实验结果表明本研究所分离的细胞在培养过程中其生长曲线呈典型的“S”型,并随着细胞代数的增加,其倍增时间逐渐延长。集落形成能力试验说明本研究所分离的细胞有形成集落的潜力,并且随着细胞接种量的增多,形成集落的数量增多。组织化学检测结果为:糖原染色阳性,碱性磷酸酶检测阴性,细胞表面标志物CD29、CD44以及波形蛋白免疫荧光染色阳性,造血干细胞表面标志物CD34、CD45免疫荧光染色阴性。RT-PCR分析结果显示BMSCs表达细胞表面标志物基因CD29、CD44、CD71,以及控制细胞多能性的转录因子Sox2、Myc、Nanog、PouV。体外分化试验表明本研究所分离的细胞具有多向分化的潜能,在特定条件下可以分化成成骨细胞和成脂细胞。嵌合体试验结果表明我们所分离的细胞有潜力成为制备嵌合体的有力工具。本研究所分离的广西黄羽鸡来源的BMSCs具有易于分离、扩增、免疫原性低以及体外培养时能长期生成并维持多系分化的潜能的特点。有希望运用于再生医学、细胞移植治疗、禽类发育生物学和转基因鸡的制备等方面。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.1
【图文】：

Ａ、Ｂ：分离后接种第５天的ＢＭＳＣｓ；邋Ｃ、Ｄ：分离后接种第１１天的ＢＭＳＣｓ邋（标尺：逡逑１００邋Ｕ邋ｍ）逡逑Ｆｉｇ．邋２－１邋ＢＭＳＣｓ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ＰＯ邋ｐｈａｓｅ邋ｓｅｐａｒａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｄｅｎｓｉｔｙ邋ｇｒａｄｉｅｎｔ邋ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ逡逑Ａ，邋Ｂ：邋ＢＭＳＣｓ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋５ｔｈ邋ｄａｙ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ；邋Ｃ，邋Ｄ：邋ＢＭＳＣｓ邋ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ邋ｏｎ逡逑ｔｈｅ邋１１ｔｈ邋ｄａｙ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｓｏｌａｔｉｏｎ邋（ｓｃａｌｅ：邋１００邋＼ｘｍ）逡逑２．３．２差速贴壁培养法纯化与培养ＢＭＳＣｓ结果逡逑根据ＢＭＳＣｓ与其他细胞贴壁能力、沉降速度的差异，通过控制消化时间和接逡逑种后首次换液时间对其进行进一步的纯化。按照本实验所建立的差速贴壁的纯化逡逑方法，ＢＭＳＣｓ逐渐得到纯化，表现为细胞形态的日渐统一。ＰＩ、Ｐ２时期在培养皿逡逑中还可看到大量的杂细胞，到Ｐ３时就可看到纯度约在９０°／。以上的ＢＭＳＣｓ。在本实逡逑验所建立的培养体系中ＢＭＳＣｓ表现出良好的生长状况，细胞呈典型的成纤维状，逡逑细胞体积大，边缘光亮，细胞形态稳定（图２－２）。逡逑

３．邋５ｃｍ的细胞培养皿中分别接种１０００和１００００个细胞时，经过７天的培养，集逡逑落逐渐形成，在倒置显微镜下观察鸡ＭＳＣ分别形成２５±８和７０±邋１０个直径大于逡逑３ｍｍ的可见集落（图２－３）。逡逑：

本文编号：2787348