重庆地区畜禽大肠埃希菌耐药性与ESBLs基因分析

发布时间：2020-08-11 16:19

【摘要】：大肠埃希菌耐药性的产生与其特性、耐药质粒传播和抗生素的使用等因素密切相关,多重耐药菌株的出现使大肠埃希菌的耐药问题日渐严重。超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是革兰阴性菌对头孢菌素类药物最重要的耐药机制,产ESBLs大肠埃希菌给人和动物健康构成严重威胁,已成为最为关注的公共卫生问题之一。本研究通过对临床分离的畜禽大肠埃希菌耐药性与ESBLs基因分析,为评价重庆地区畜禽细菌耐药现状、ESBLs耐药基因流行规律提供依据。本试验以2014-2016年从重庆7个区县13个养殖场分离的1455株鸡、猪和牛源大肠埃希菌为对象,测定其对抗生素的敏感性,并检测了所有分离菌的多重耐药基因、ESBLs耐药基因类型,对部分分离菌进行了多位点可变数串联重复分析法(MLVA)分型。主要结果如下:(1)1455株分离菌对28种抗生素均有不同程度的耐药性,耐药率在1.1%-89.1%之间。试验菌对碳青霉烯类的亚胺培南和氨基糖苷类的阿米卡星最为敏感,耐药率仅有1.1%和5.4%,对阿莫西林耐药最为严重,耐药率平均达到89.10%。氨基糖昔类、四环素类、酰胺醇类和喹诺酮类药物中耐药率最高的分别是安普霉素(45.5%)、四环素(68.8%)、氟苯尼考(55.9%)和萘啶酸(46.1%)。牛源菌株对氨基糖苷类药物和喹诺酮类药物耐药均在5%以下,并且对诺氟沙星100%敏感。(2)所有分离菌多重耐药现象明显,对0-5、6-10、11-15、16-20、21-25和26-28种药物耐药菌株分别占总分离菌株的15.7%、17.6%、27.7%、22.7%、15.1%和1.2%。其中1株分离自养猪场菌株对28种药物耐药,1株分离自牛场的菌株对所有药物敏感。鸡源菌株普遍比猪源、牛源菌株耐药性严重;冬、春季节的分离株耐药率普遍高于夏秋季分离菌;不同区县鸡源分离菌耐药率差异不明显,但各饲养场猪源分离菌的耐药率存在一定差异。(3)1455株大肠埃希菌中,有1398株携带1种以上ESBLs基因,占所有菌株数的96.1%。这些菌株共有12种ESBLs基因类型。blaTEM和blaCTX-M型耐药基因在重庆地区养殖场中普遍存在,blaTEM基因型最多(59.3%),其次为blaTEM+CTx-M(21.9%)。(4)采用MLVA分型方法对2014-2015年分离的399株E.coli鸡源与猪源分离株进行了基因分型,筛选出具有高分辨率适用于重庆地区大肠埃希菌基因的6个MLVA位点组合(GECM-6),并构建了E.col分离株MLVA分型结果进化树,该进化树将大肠埃希菌按各位点等位基因数目的不同共分为263个GECM-10菌株型,所有菌株MLVA分型结果比较分散,得到不同类型的GECM-10菌株型,未发现占绝对优势的GECM-10菌株型,菌株在基因水平上具有多态性,且不同区域菌株的GECM-10菌株型差异比较明显。总之,本研究对1455株分离菌在来源、季节、用药情况等方面进行了系统分析,揭示了重庆地区畜禽源大肠埃希菌的耐药现状、规律和多重耐药现象,为指导临床用药提供了依据;检测出重庆地区产ESBLs畜禽源大肠埃希菌有12种基因类型,其中blaTEM和blaCTX-M为重庆地区ESBLs优势基因型,为合理用药提供了理论保证;筛选出具有高分辨率的6个MLVA位点新组合(GECM-6),适用于重庆甚至西南地区畜禽大肠埃希菌的日常基因分型检测和暴发时的流行病学调查,可从源头上控制和减少多重耐药菌株的产生。
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.61
【图文】：

核苷酸序列,大肠埃希菌,特异性基因

２．３．２大肠埃希菌分离鉴定结果逡逑大肠埃希菌在麦康凯平板上形成表面光滑湿润、边缘整齐的桃红色菌落；革兰氏逡逑染色后镜检可见细菌为短杆状的革兰氏阴性细菌（图２－１）。逡逑八逦Ｂ逡逑；ｖ＊逦％逦二．逡逑＇＿逦－？逦－邋ｇ邋－邋ｔ邋＼逦＇邋Ｋ逡逑图２－１大肠埃希菌临床分离株在麦康凯平板上的生长状况及革兰氏染色结果逡逑Ａ：临床分离株在麦康凯琼脂培养基上的生长情况；Ｂ：临床分离株革兰氏染色结果。逡逑Ｆｉｇ．２－１邋Ｅ．邋ｃｏｌｉ邋ｉｓｏｌａｔｅ邋ｗａｓ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｏｎ邋ＭａｃＣｏｎｋｅｙ邋ｐｌａｔｅａｎｄ邋ｇｒａｍ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｒｅｓｕｌｔｓ．逡逑Ａ：邋Ｅ．邋ｃｏｌｉ邋ｉｓｏｌａｔｅ，邋Ｂ：邋Ｇｒａｍ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ．逡逑大肠埃希菌菌株的鉴定采用ＰＣＲ扩增大肠埃希菌特异的；基因。所分离的大逡逑肠埃希菌均能够扩增出单一的与预期大小相同的７２０邋ｂｐ的条带（图２－２）。选取部分逡逑扩增的ＰＣＲ产物测序，所有产物的核苷酸序列均与；核苷酸序列相同，证明扩增逡逑的片段为；基因片段。逡逑７２０逡逑４００逦｜ｌａ｜＆：：：－：逡逑图２－２临床分离株大肠埃希菌特异性基因＃７0Ａ邋ＰＣＲ忙增结果逡逑Ｆｉｇ．２－２邋Ｔｈｅ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｐｒｏｄｕｃｔｓ邋ｏｆ邋Ｅ．邋ｃｏｌｉ邋ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｇｅｎｅ邋ｐｈｏＡ邋ｉｎ邋ｉｓｏｌａｔｅｓ．逡逑Ｍ．邋１００邋ｂｐ邋ｌａｄｄｅｒ；邋１－２４．临床分离菌株ｐ／ｚｏｄ基因片段逡逑Ｍ．邋１００邋ｂｐ邋ｌａｄｄｅｒ，邋１－２４．邋Ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ｐｈｏＡ邋ｆｒａｇｍｅｎｔ邋ｉｎ邋ｉｓｏｌａｔｅｓ．逡逑以大肠埃希菌ＡＴＣＣ邋２５９２２为阳性对照

核苷酸序列,大肠埃希菌,革兰氏染色,琼脂培养基

大肠埃希菌,畜禽,养鸡场,情况

第二章重庆地区畜禽源大肠埃希菌耐药性分析逡逑牛源菌株１０８株，鸡源、猪源和牛源菌株分离率分别为８５．６％、８２．８％和７７．１％，详逡逑见表２－６，图２－３。逡逑表２－６不同动物源大肠埃希菌分离情况逡逑Ｔａｂｌｅ邋２－６邋Ｔｈｅ邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋Ｅ．邋ｃｏｌ：邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ａｎｉｍａｌｓ逡逑样品类型样品数菌株数逦分离率％逡逑猪源逦５９５逦４９３逦８２．８逡逑鸡源逦９９８逦８５４逦８５．６逡逑牛源逦１４０逦１０８逦７７．１逡逑合计逦１７３３逦１４５５逦８１９逦逡逑不同畜食源大肠埃希茴分离情况逡逑２０００逡逑１ＳＯＯ逦１７３３逡逑■逦Ｂ猪源Ｑ１约源Ｈ牛涵□合计逡逑？Ｓ５逡逑３０００逦ｍｍ邋＾逦？逦＿逡逑＾逦媝邋Ｐｉ邋W逡逑Ｉ逦■邋Ｉ逦自邋Ｂ逡逑１，４０逦１０８逦８２．８逦８５．６逦７７．１逦８３．９逡逑样品数逦苗株＊ａ逦分离本％逡逑图２－３不同畜禽源大肠埃希菌分离情况逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｔｈｅ邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋Ｅ．邋ｃｏｌｉ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｆｒｏｍ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ａｎｉｍａｌ邋ｓｐｅｃｉｅｓ．逡逑２．３．３不同养殖场菌株分离情况逡逑从样品的不同采集地点来看，在１３个养殖场即养猪场１、养猪场２、养猪场３、逡逑养猪场４、养鸡场１、养鸡场２、养鸡场３、养鸡场４、养鸡场５、养鸡场６、养牛场１、逡逑养牛场２和屠宰场分别分离到１２４株、１０９株、１２２株、５０株、１６３株、１５６株、１８９逡逑株、１３５株、１１７株、９４株、３２株、７６株和８８株大肠埃希菌（表２－７?

【参考文献】