Ran对小鼠C2C12成肌细胞分化的影响

发布时间：2020-08-12 02:32

【摘要】：随着生活水平的提高,肉类食品在食物构成中所占的比例不断增加,人们对肉类食品品质的要求也越来越高。目前,国内肉用牛养殖中品种繁多,牛肉产量偏低、品质也参差不齐,牛肉的产量和质量已不能满足人们的需求。通过遗传育种的方式获得高品质的肉牛品种是目前解决这一问题最快速有效的方法。另外,在骨骼肌受到损伤时,潜伏的骨骼肌卫星细胞可以通过增殖和分化完成肌纤维的再生,修复损伤的肌肉组织。因此,研究肌肉分化的机理不仅具有巨大的商业价值,也能够为医学领域内相关疾病的治疗提供新思路。Ran(Ras-related nuclear protein,Ran)作为真核生物细胞中含量最为丰富的小G蛋白,参与细胞分裂间期的核质转运、DNA复制和RNA转录;在细胞分裂期参与核膜破裂、纺锤体组装、染色体分配、核膜装配和细胞分裂等细胞过程。肌肉分化是肌源性细胞通过增殖、分化和彼此间相互融合成多核肌管,并最终形成具有收缩功能的肌纤维的过程。本研究以小鼠C2C12成肌细胞为研究对象,通过Ran的过表达和siRNA干扰研究Ran的对C2C12细胞体外分化过程的影响,并进一步探究Ran对分化影响的可能机制。具体实验内容及结果如下:(1)Ran在C2C12细胞分化过程中的表达:分别收集分化0 d至5 d的C2C12细胞蛋白样,进行Western blot实验。结果显示,随着C2C12细胞分化程度的提高,Ran的表达量也逐渐升高。(2)Ran在C2C12细胞分化过程中的分布:通过对未分化、分化早期、分化中期和分化晚期的C2C12细胞进行间接免疫荧光染色。发现在未分化的C2C12细胞中,Ran主要聚集于细胞核内;随着分化时间的延长,Ran在细胞质中的浓度升高。(3)Ran过表达对C2C12细胞分化的影响:构建Ran的过表达载体,转入C2C12细胞中。Western blot结果表明,Ran表达量升高,MyoG和MYH的表达量也显著升高;间接免疫荧光染色结果显示,C2C12细胞的肌管融合率明显升高。Ran表达量的升高促进了C2C12细胞的分化。(4)Ran的siRNA干扰对C2C12细胞分化的影响:Ran的siRNA干扰片段转入C2C12细胞中。Western blot结果表明,Ran表达量降低,MyoG和MYH的表达量也明显降低;间接免疫荧光染色结果显示,C2C12细胞的肌管融合率明显下降。Ran表达量的降低抑制了C2C12细胞的分化。(5)TGF-β/Smad信号通路对C2C12细胞分化的影响:C2C12细胞中添加TGF-β/Smad信号通路抑制剂LY2109761。Western blot检测发现,磷酸化smad2的含量降低,MyoG和MYH的表达量也明显降低。LY2109761的添加抑制了C2C12细胞的分化。(6)Ran对TGF-β/Smad信号通路的影响:分别使用Ran的过表达载体和siRNA干扰片段来改变Ran在C2C12细胞分化过程中的表达量。Western blot结果表明,在C2C12细胞分化第2 d,Ran的表达量升高,Smad2的蛋白含量也显著提高;Ran的表达量降低,Smad2的蛋白含量也明显降低。而在分化第4 d和第6 d,Smad2的蛋白含量不受Ran表达量变化的影响。在C2C12细胞分化的不同时期,Ran表达量升高时,磷酸化Smad2的含量均显著升高;Ran的表达量下降时,磷酸化Smad2的含量也均显著降低。Ran的表达量升高激活TGF-β/Smad信号通路,Ran的表达量下降抑制TGF-β/Smad信号通路。(7)C2C12细胞的分化过程中,Ran与TGF-β/Smad信号通路之间的关系:LY2109761处理后,C2C12细胞中磷酸化Smad2的含量降低,MyoG和MYH的表达量也显著降低;LY2109761处理C2C12细胞并转入Ran过表达载体,Ran表达量的升高,使磷酸化Smad2的含量和MyoG与MYH的表达量恢复到不添加抑制剂时的水平。说明Ran可以通过提高TGF-β/Smad信号通路中Smad2和磷酸化Smad2的含量促进C2C12细胞分化。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S852.2
【图文】：

骨骼肌,暗带,肌节

东北农业大学农学硕士学位论文相邻 Z 线之间的区域被称为一个肌节，包括位于中间部位的暗带的明带τI 带υ，是肌纤维中最小的结构和功能单位[9,10]，见图 1-2[7

肌小节,肌原纤维,肌丝,肌纤维

2图 1-2 肌小节Fig.1-2 sarcomere维内又包含成百上千条与纤维长轴平行的肌原纤维[11] 肌原纤维不同的肌丝，且粗细肌丝之间存在不同程度的重叠所造成的要由粗肌丝构成粗细肌丝间的规律性空间排布，是肌肉收缩的除了粗细肌丝之外，还有由巨蛋白组成的有弹性的肌丝，他从细内延伸并与 M 线接触，将粗细肌丝连接在一起，故也称肌连蛋持粗细肌丝之间的相对位置和正常结构外，还能够制约肌小节的] 由众多肌球蛋白分子构成，每个肌球蛋白由 2 条缠绕在一起的重调节轻链共同组成[7,8]，见图 1-3[8] 2 条重链的尾部相互缠绕形成

肌丝,肌动蛋白,肌钙蛋白,原肌球蛋白

图 1-3 粗细肌丝的组成Fig.1-3 The composition of thick and thin myofilament由肌动蛋白原肌球蛋白和肌钙蛋白组成[7,8]，见图 1-3 许多球形聚合形成两条长链，相互之间呈双螺旋式缠绕，构成细肌丝的主干固定在肌原纤维的 Z 线处，另一端插入粗肌丝之间，肌动蛋白的单在骨骼肌处于静息状态时，原肌球蛋白沿肌动蛋白双螺旋的线沟依位于肌动蛋白和横桥之间，将肌动蛋白上的横桥结合位点遮盖，阻，产生位阻效应[11] 肌钙蛋白是一种球形的复合蛋白，由 T C I 亚基负责将肌钙蛋白连接到原肌球蛋白；C 亚基对 Ca2+有很强的亲白结合，使原肌球蛋白保持在肌动蛋白双螺旋线沟上[14,15] 肌的功能骨骼肌运动的动力来源，而收缩的实质是：肌纤维将 ATP 分解释放机械能这种能量的转换主要发生在横桥与肌动蛋白的反复作用过维细胞质中的 Ca2+浓度升高后，Ca2+与细肌丝上的肌钙蛋白 C 亚基发生改变，导致肌钙蛋白 I 亚基与肌动蛋白的亲和力减弱，原肌球内移动，解除位阻效应[17,18] 此时，肌动蛋白上的横桥结合位点暴

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