猪源SCCmecⅫ型耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性、分子分型及全基因组序列分析

发布时间：2020-08-14 23:39

【摘要】：猪源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)不仅严重危害养殖业,还对生物食品安全以及公共卫生安全带来极大的威胁。然而,我国生猪养殖加工销售链中猪源MRSA的流行病学特征仍缺乏系统的评估,其流行克隆的遗传进化特征也缺少系统的阐述。因此,本研究在2014年10月至2015年9月从厦门某养殖场、屠宰加工环节以及超市采集1485份猪源样本,评估猪源MRSA菌株在整个猪肉生产加工销售过程中各个环节的污染状况;采用纸片法调查猪源MRSA菌株对21种抗生素的药物敏感性;通过聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测猪源MRSA菌株中的38个耐药基因、37个毒力基因以及可移动元件(mobile genetic elements,MGEs)lsa(E)基因簇和Tn558的携带情况;通过葡萄球菌基因盒(Staphylococcal cassette chromosome mec,SCCmec)分型、多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)、金黄色葡萄球菌蛋白A基因多态性分型(spa分型)以及脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE)分型探究不同环节中猪源MRSA的流行克隆;利用二代高通量全基因组测序技术研究其流行克隆的遗传进化、抗性和毒力基因的遗传背景。1、采样共1485份,分离到猪源MRSA共54株,检出率为3.6%。其中,养猪场、屠宰加工环节以及超市的检出率分别为2.4%(13/542)、4.0%(31/780)以及6.1%(10/163)。药物敏感性试验结果显示,来自养殖场的MRSA菌株对≥6类抗生素耐药的菌株比例为100.0%(13/13),大于屠宰加工环节(80.6%,25/31)以及超市(40.0%,4/10)的比例。2、同时携带lsa(E)基因簇和Tn558的MRSA在养殖场(92.3%,12/13)中MRSA的比例高于屠宰加工环节(80.6%,25/31)和超市(10.0%,1/10)的比例。毒力基因hla、hlb、seg、sei、sem、ebpS、fnbA和cap5基因在养殖场(84.6%,84.6%,84.6%,100.0%,100.0%,100.0%,100.0%,100.0%)中MRSA的携带率也高于来自屠宰加工环节(77.4%,74.2%,64.5%,67.7%,90.3%,93.5%,90.3%,87.1%)和超市(70.0%,20.0%,0.0%,0.0%,70.0%,10.0%,90.0%,60.0%)。而且,能凝固牛血浆和山羊血浆的MRSA菌株占养殖场中菌株的比例(100.0%,13/13)高于来自屠宰加工环节(90.3%,28/31)和超市环节(20.0%,2/10)的比例。3、分子分型试验结果显示,养殖场和屠宰加工环节的菌株以ST9-MRSA-SCCmecⅫ型为主,分别占84.6%(11/13)和80.6%(25/31),但是ST9-MRSA-SCCmecⅫ型菌株未能在超市发现。而且,14株属于ST9-MRSA-t899-SCCmecⅫ/J的相似菌株分别来自猪养殖场以及屠宰加工环节,表明ST9-MRSA-t899-SCCmecⅫ可能在猪养殖场和屠宰加工环节之间传播。4、利用软件OrthoMCL和kSNP构建系统发生树来评估测序的两株猪源ST9-MRSA-SCCmecⅫ型菌株与135个早先报道过的金葡菌之间的进化关系。这135个金葡菌参考基因组序列中含有78株来自人源金葡菌株,39株来自牛源金葡菌株以及18株来自猪源金葡菌株。这135株参考菌株包括11株ST9-MRSA-SCCmecⅫ菌株,62株非ST9-MRSA-SCCmecⅫ型MRSA菌株以及62株MSSA菌株,系统发生树结果表明来自不同宿主(猪、牛、人)的ST9-MRSA-SCCmecⅫ型菌株属于同一分支。与其他非ST9-MRSA-SCCmecⅫ型金葡菌相比,所有ST9-MRSA-SCCmecⅫ菌株都含有可移动元件(SCCmecⅫ、SaPIbov4、Tn552以及lsa(E)基因簇)。5、两株猪源ST9-MRSA-SCCmecⅫ型菌株M3和M6中发现携带新的V型νSaα基因组岛,该结构同时携带有氨基糖苷类耐药基因aadE以及毒力基因vwb、scn、ssl、lpl等。相比于牛源ST9-MRSA-SCCmecⅫ型克隆BA01611的基因组序列,猪源菌株M3和M6基因组的黏附素基因上具有相同的非同义替换以及在磷酸ABC盐转运假基因上具有相同的插入缺失(Insertion/deletions,indels)。综上所述,该生猪养殖加工销售链中猪源MRSA菌株的流行克隆为ST9-MRSA-SCCmecⅫ型,该克隆菌株都对≥6类抗生素耐药、携带可移动元件lsa(E)基因簇和Tn558、含有多个毒力基因以及均能凝固反刍动物血浆。而且,ST9-MRSA-SCCmecⅫ型克隆可能在猪、牛、人之间传播。这些ST9-MRSA-SCCmecⅫ型克隆在不同宿主中定植的关键很可能是其携带多种可移动元件,包括新V型νSaα基因组岛。该克隆在不同宿主之间传播过程中,基因组携带黏附素基因以及新陈代谢相关基因的功能可能会发生改变。
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S852.611
【图文】：

元件结构,元件

华南理工大学博士学位论文ec 元件元件中分子量最大的，约为 67kb[104]。该元件的 J 区域携因的质粒和转座子，包括含有四环素耐药基因的质粒 pT181，含座子 Tn554 以及含有重金属镉抗性基因的假 Tn554 结构。IV 型美国被报道，分子量约为 21-24kb[106]。V 型 SCCmec 元件首次是量约为 28kb[107]。相比于其他 SCCmec 元件，IV 型和 V 型 SCCm移动性较强。

原理图,序列分析,原理图,重复序列

图 1-2 多位点序列分析原理图[124]Figure 1-2 The principal of MLST[124]a 分型SA 中，编码 SPA 蛋白的 spa 基因的下游 X 区域内的重复序列具有多态根据该重复序列的多态性进行的序列分型方法。spa 基因的下游 X 区为 24bp 的重复序列（Repeat，r）。不同克隆来源菌株的这些重复序列式具有差异。因此，将测试菌株的该区域的序列结果上传到www.ridom.de/spaserver/）中，确定重复序列的种类和排列顺序（rA-序列组成信息与数据库中标准的 spa 型别的重复序列组成信息进行对特定的 spa 型别（Type，t）。如果测试菌株含有新的未曾发现的重复方式，可以通过上传数据库审核测序结果，对该重复序列或重复序列然 spa 分型的分辨力不如 PFGE 高，但是该方法耗时较短、价格低廉性强、实验仪器要求较低，因此对于 MRSA 的流行爆发研究更为适

分型,鸡源,博士学位论文,华南理工大学

华南理工大学博士学位论文133、CC398 等；鸡源 MRSA 中出现过 CC5、CRSA 中出现过 CC1、CC8、CC398 等克隆群；羊隆群[117]。值得注意的是，CC97 型 MRSA 是引区相关 MRSA 的主要流行克隆之一，研究表明捕获甲氧西林耐药性之后又传播到人类中[134]。要流行克隆群[23, 135]，其中猪是 CC398 克隆群SA 大多属于 CC9 克隆群[5, 27, 136]。

【参考文献】